Эффективный и экономичный метод электропорации для изучения первичных реснично-зависимых сигнальных путей в предшественнике гранулярной клетки
30 ноября 2021 г.
Здесь мы представляем воспроизводимый протокол электропорации in vitro для генетических манипуляций с первичными предшественниками клеток гранул мозжечка (GCP), который является экономически эффективным, эффективным и жизнеспособным. Кроме того, этот протокол также демонстрирует простой метод молекулярного исследования первичных реснечно-зависимых сигнальных путей Hedgehog в первичных клетках GCP.
Этот протокол демонстрирует простой метод генетической модификации in vitro для молекулярного исследования первичного ресничкового сигнального пути в культурах-предшественниках первичных гранул клеток. Из-за стоимости, низкой жизнеспособности и низкой эффективности метода трансформации тока мы внедряем простой, экономически эффективный и эффективный метод электропорации для исследования ресничкового сигнального пути в первичных культурах GCP. Для начала добавьте 0,5 миллилитра питательной среды в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины, содержащей покрытые крышкой, и держите ее в тепле при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа.
Пипетка необходимого количества клеток в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и вращение при 200хГ в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 200 микролитрах Opti-MEM. Повторите эту процедуру дважды, чтобы убедиться, что в пробирке нет остаточной питательной среды.
Задайте параметры электропорации, как указано в списке. Пипетку реакции электропорации аккуратно перемешать, и использовать длинный наконечник пипетки Р200 для переноса точного объема в 100 микролитров смеси в двухмиллиметровый зазор кюветы. Как только кювета окажется внутри камеры кюветы, нажмите кнопку омега электропоратора и запишите значение импеданса, придерживаясь точного объема в 100 микролитров.
Диапазон значений импеданса должен быть приблизительно 30 и 35. Нажмите кнопку запуска, чтобы запустить импульс. Запишите измеренные значения тока в джоулях, показанные на кадре считывания.
Выньте кювету из камеры. Немедленно добавьте в кювету 100 микролитров предварительно подогретой питательной среды и повторно суспендируйте ее, пипеткой вверх и вниз два-три раза. Немедленно перенесите клеточную суспензию на 24-луночную пластину, предварительно подготовленную.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе углекислого газа. Понаблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом на следующий день. В настоящем исследовании эффективность электропорации групп, обработанных ДМСО и SAG, оказалась сопоставимой.
Иммуноокрашивание маркера первичной реснички Arl13b демонстрирует, что скорость цилиляции GCP при div-2 культуры как в транспортной, так и в SAG-обработанной группах. Скорость милиции иллюстрирует процент Pax6 экспрессирующих GCP, несущих первичную ресничку на поверхности клетки при div-2 после электропорации. На рисунке показано значительное увеличение сглаженной локализации EGFP на первичной аксонеме реснички экспрессии клеток GCP Pax6 через 24 часа после лечения SAG, что указывает на глубокую активацию первичного сигнального пути ресничкового ежа.
Для достижения более высокой эффективности электропорации следует обеспечить высокую чистоту используемой плазмиды, а в плазмидной электропорационной смеси отсутствуют остаточные питательные среды. Этот протокол должен быть непосредственно применим и полезен для экспериментов по генетической модификации in vitro на первичных культурах и типах клеток, которые трудно трансфектировать, включая нейроны и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование представляет воспроизводимый протокол in vitro электропорации, разработанный для генетической манипуляции с первичными прекурсорами гранулярных клеток мозжечка (GCPs). Оно фокусируется на методе, который является как экономически эффективным, так и эффективным для изучения зависящих от первичного реснички сигнальных путей Hedgehog.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генетическая манипуляция
- Клеточная сигнализация
Предпосылки
- Первичные прекурсоры гранулярных клеток мозжечка (GCPs) имеют ключевое значение для изучения нейронального развития.
- Текущие методы трансфекции часто являются неэффективными и дорогостоящими.
- Первичная ресничка жизненно важна для различных сигнальных путей, включая сигнальные пути Hedgehog.
- Электропорация предлагает потенциальное решение этих проблем.
Цель исследования
- Внедрить эффективную технику электропорации для культуры GCP.
- Способствовать изучению сигнальных путей, зависящих от первичной реснички.
- Улучшить результаты генетической манипуляции в трудных для трансфекции типах клеток.
Используемые методы
- В эксперименте использовались in vitro культуры первичных GCP.
- Протокол электропорации включал специфические параметры для эффективной генетической модификации.
- Мультиомика не упоминалась в исследовании.
- Критические шаги включали взвешивание клеток и последовательность электропорации.
- Иммуногистохимическое окрашивание использовалось для оценки уровня ресничек и активации сигнальных путей.
Основные результаты
- Протокол продемонстрировал значительное увеличение активации сигнального пути Hedgehog в обработанных GCP.
- Иммуногистохимическое окрашивание выявило заметное увеличение уровня ресничек в GCP после электропорации.
- Исследование предоставило представление об эффективности электропорации по сравнению с традиционными методами.
- Было сделано заключение, что высокая чистота плазмид является решающим фактором для успеха электропорации.
Выводы
- Это исследование представляет ценный протокол для генетической манипуляции в первичных GCP.
- Результаты улучшают понимание механизмов сигнализации, зависящих от первичной реснички.
- Будущие применения могут включать различные типы клеток, которые сложны для генетической манипуляции.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Efficient genetic manipulation of primary granule cell precursors (GCPs) is essential for elucidating cilium-dependent signaling mechanisms that underpin neurodevelopmental and disease pathways. This electroporation protocol delivers high transfection efficiency and cell viability, enabling robust interrogation of Hedgehog pathway dynamics in disease-relevant systems. The method supports predictive confidence in early discovery and target validation for signaling pathway modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional genetic interrogation of cilium-dependent Hedgehog signaling in primary GCPs.
- Supports mechanistic de-risking by allowing direct visualization of pathway component localization.
- Facilitates target validation through reproducible manipulation of signaling nodes in disease-relevant cells.
Screening & Assay Development
- Prepares validated primary cell systems for downstream screening of pathway modulators.
- Delivers high transfection efficiency (~80-90%) and reproducibility for quantitative assay outputs.
- Enables scalable and cost-effective assay development for difficult-to-transfect neuronal models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant cellular phenotypes for translational continuity.
- Supports biomarker discovery by enabling dynamic tracking of signaling protein localization.
- Reduces biological risk in preclinical advancement by providing robust mechanistic data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the early discovery and target validation stages, bridging genetic manipulation with quantitative pathway analysis in primary neuronal systems.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in primary GCPs.
- Screening: Provides reproducible, high-efficiency transfection for assay readiness and quantitative readouts.
- Analytics: Enables measurement of ciliation rates and pathway activation via immunostaining and fluorescence microscopy.
- Translational Research: Connects in vitro mechanistic insights to disease-relevant cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable platform for genetic modification in challenging primary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pathway studies.
- Operational Value: Standardizes genetic manipulation with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of signaling pathway targets and modulators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal culture and electroporation techniques.
- Needs access to electroporation instrumentation and fluorescence microscopy for analysis.
- Demands cross-team standardization of plasmid purity and media removal protocols.
- Adaptable to other difficult-to-transfect primary cell types with protocol optimization.
- Efficiency depends on precise control of electroporation parameters and sample preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
