Эффективный и экономичный метод электропорации для изучения первичных реснично-зависимых сигнальных путей в предшественнике гранулярной клетки

Этот протокол демонстрирует простой метод генетической модификации in vitro для молекулярного исследования первичного ресничкового сигнального пути в культурах-предшественниках первичных гранул клеток. Из-за стоимости, низкой жизнеспособности и низкой эффективности метода трансформации тока мы внедряем простой, экономически эффективный и эффективный метод электропорации для исследования ресничкового сигнального пути в первичных культурах GCP. Для начала добавьте 0,5 миллилитра питательной среды в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины, содержащей покрытые крышкой, и держите ее в тепле при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа.

Пипетка необходимого количества клеток в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и вращение при 200хГ в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 200 микролитрах Opti-MEM. Повторите эту процедуру дважды, чтобы убедиться, что в пробирке нет остаточной питательной среды.

Задайте параметры электропорации, как указано в списке. Пипетку реакции электропорации аккуратно перемешать, и использовать длинный наконечник пипетки Р200 для переноса точного объема в 100 микролитров смеси в двухмиллиметровый зазор кюветы. Как только кювета окажется внутри камеры кюветы, нажмите кнопку омега электропоратора и запишите значение импеданса, придерживаясь точного объема в 100 микролитров.

Диапазон значений импеданса должен быть приблизительно 30 и 35. Нажмите кнопку запуска, чтобы запустить импульс. Запишите измеренные значения тока в джоулях, показанные на кадре считывания.

Выньте кювету из камеры. Немедленно добавьте в кювету 100 микролитров предварительно подогретой питательной среды и повторно суспендируйте ее, пипеткой вверх и вниз два-три раза. Немедленно перенесите клеточную суспензию на 24-луночную пластину, предварительно подготовленную.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе углекислого газа. Понаблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом на следующий день. В настоящем исследовании эффективность электропорации групп, обработанных ДМСО и SAG, оказалась сопоставимой.

Иммуноокрашивание маркера первичной реснички Arl13b демонстрирует, что скорость цилиляции GCP при div-2 культуры как в транспортной, так и в SAG-обработанной группах. Скорость милиции иллюстрирует процент Pax6 экспрессирующих GCP, несущих первичную ресничку на поверхности клетки при div-2 после электропорации. На рисунке показано значительное увеличение сглаженной локализации EGFP на первичной аксонеме реснички экспрессии клеток GCP Pax6 через 24 часа после лечения SAG, что указывает на глубокую активацию первичного сигнального пути ресничкового ежа.

Для достижения более высокой эффективности электропорации следует обеспечить высокую чистоту используемой плазмиды, а в плазмидной электропорационной смеси отсутствуют остаточные питательные среды. Этот протокол должен быть непосредственно применим и полезен для экспериментов по генетической модификации in vitro на первичных культурах и типах клеток, которые трудно трансфектировать, включая нейроны и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки.