Быстрая изоляция диких нематод воронкой Baermann

Caenorhabditis nematodes – это настоящие животные, которые живут в природе. Сбор диких нематод позволяет изучать гены и геномы в их естественном контексте, выявляя функции, которые могут быть скрыты искусственными условиями лаборатории. Этот метод извлекает червей из богатых бактериями органических субстратов в поле и создает чистые культуры на чашках Петри, захватывая снимок каждой популяции в то время, когда она была собрана.

Эти популяции хорошо подходят для вопросов экологии, популяционной генетики или метагенетики. Дикие штаммовые культуры также ценны для количественных генетических исследований. Эта техника проста и удобна в исполнении даже для новичка в полевых исследованиях.

Однако успешная коллекционная поездка, требует вдумчивой подготовки материалов, перед поездкой. Определите богатый бактериями субстрат в поле, такой как гниющие фрукты, цветы, грибы, стебли травянистых растений, почва или опавшие листья. Поместите небольшой объем подложки в маркированный полиэтиленовый пакет.

Если гниющий материал редко встречается в интересующей полевой стороне, поместите некоторые фрукты в качестве приманки. Оставьте его раскачиваться, а затем извлеките его и любых червей, которые колонизировали его. Запишите идентификатор образца, широту, долготу, дату и описание субстрата.

Запишите любые другие локальные измерения окружающей среды, имеющие отношение к эксперименту, такие как температура окружающей среды и субстрата, состояние субстрата, время сбора и наличие макробеспозвоночных, связанных с субстратом. Используйте ножницы, чтобы вырезать трехсантиметровый сегмент резиновой трубки из каждой воронки. Установите трубку на конец пластиковой воронки.

Сдвиньте зажим трубки на резиновую трубку и зажмите ее. Чтобы сделать воронку держателя, вырежьте круглые отверстия, в центре развернутого картона мухи мерзкого лотка. Переверните картон, сложите стороны вверх один раз и скрепите их вместе.

Это создаст ножки, которые поднимут отверстия над скамейкой. Убедитесь, что зажимы трубки находятся в закрытом положении, и поместите воронки в отверстия. Налейте стерильную воду в каждую воронку, заполнив ее примерно на три сантиметра ниже края.

Нажмите на воронку, чтобы выпустить любые захваченные пузырьки воздуха в трубке. Сложите безворсовую салфетку пополам, чтобы сделать квадрат, и поместите ее над воронкой. Затем нажмите на салфетку, чтобы погрузить ее в воду.

Вручную разбейте любые крупные твердые куски натуральной подложки. Аккуратно поместите часть образца на салфетку в воронке. Убедитесь, что вы не прокололи салфетку или не оставили какой-либо образец выступающим над ободом.

Аккуратно сложите углы салфетки над образцом, чтобы вода не стекала, через край воронки. Пометьте воронку идентификатором образца, соответствующим заметкам о коллекции полей. Выделите любых активных насекомых или других животных, которые могут путешествовать и перекрестно загрязнять образцы.

Добавьте больше воды в каждую воронку, чтобы погрузить весь образец. Во время инкубации при комнатной температуре в течение ночи активные нематоды будут покачиваться через ткань и опускаться на дно воронки. Напишите идентификатор образца воронки, на дне шестисантиметровой пластины червя NGM, сидящей с пятном бактерий OP50 E.coli.

Снимите крышку с тарелки, снимите воронку, содержащую образец, с подставки для воронки и держите ее вертикально, над открытой червячной пластиной, одной рукой. Снимите давление на зажим трубки другой рукой и дайте одной или двум каплям воды упасть из трубки на червячную пластину рядом с бактериальным газоном. Как только вода упадет из воронки, быстро зажмите ее снова, чтобы предотвратить затопление плиты NGM.

Для очистки выбросьте содержимое воронок, и промойте их горячей водой, для последующего повторного использования. Наблюдайте за изолированными нематодами под стереомикроскопом. В дополнение к нематодам, иногда будут небольшие, олиго-китовые кольчатые черви, тихоходки, коловратки и мелкие ракообразные.

Чтобы установить гермафродит ISO или женские линии ISO, перенесите каждый гермафродит L4 или спаренную взрослую самку на отдельную 3,5-сантиметровую пластину NGM, сидящую с OP50. Стерилизуйте червячок до и после каждой передачи. Наконец, тщательно оберните тарелки для путешествий парафиновой пленкой.

На острове Барро Колорадо Панама в 2018 году этим методом был обработан 131 субстрат. 99% из которых дали нематоды. 34% дали Caenorhabditis нематод.

В Чернобыльской зоне отчуждения Украины в 2019 году этим методом было обработано 170 субстратов. 56% из которых дали нематоды, ни одна из которых не была Caenorhabditis. Этот метод работает, потому что нематоды плавают через салфетку.

но субстрат и другие животные остаются на вершине. Многие аспекты протокола могут быть изменены, чтобы использовать любые ресурсы, доступные в полевых условиях. Образцы, собранные с использованием этого метода, позволяют исследователям решать широкий спектр вопросов популяционной биологии в установленных культурах для последующих лабораторных исследований.