Генерация модели ишемии крючка-реперфузии с использованием трехдневного развивающегося эмбриона цыпленка

Привет, я доктор Сайед Шадаб Раза, главный исследователь Лаборатории стволовых клеток и восстановительной неврологии, расположенной на кафедре биотехнологии в университетском городке Эра, Лакхнау, Индия. В моей лаборатории мы стремимся понять патофизиологический механизм, лежащий в основе расстройств ишемии-реперфузии, и вмешательства, которые могут обратить эти процессы вспять. В этом контексте мы часто используем модель ишемического инсульта in vitro и in vivo.

Недавно мы создали модель ишемическо-реперфузионного повреждения в трехдневном развитии эмбриона цыпленка. Итак, теперь мои студенты покажут вам, как воспроизвести травму ишемии-реперфузии в трехдневном развивающемся эмбрионе цыпленка. Теперь мы покажем вам, как создать ишемию-реперфузию в трехдневном эмбрионе цыпленка.

Наша модель экономична, эффективна по времени и воспроизводима. Итак, приступим. День первый.

Требования к первому дню. Процедура. Очистите яйцо нулевого дня 70% этанолом, используя салфетки из папиросной бумаги. Затем напишите текущий день, дату, на яйца с маркером OHP, а затем поместите яйца в инкубатор для яиц с температурой от 36 до 37 градусов по Цельсию и влажностью от 60 до 65%.

Инкубируйте яйца в течение следующих 24 часов. День второй. Требования ко второму дню. Процедура.

Протрите хирургические ножницы 70% этанолом или автоклавом. После 24 часов инкубации выньте яйцо из инкубатора для наслоения. Затем прикрепите небольшой кусочек Sellotape длиной и шириной примерно в один дюйм к краю яйца, а затем сделайте небольшое отверстие в краю яичной скорлупы с помощью ножниц с острым краем с последующим введением шприца в пять мл под углом примерно 75 градусов.

После введения иглы в желточный мешок медленно выведите пять-шесть мл альбумина. После удаления альбумина повторно запечатайте отверстие с помощью Sellotape и поместите яйцо обратно в инкубатор яиц с температурой 37 градусов по Цельсию в течение следующих 48 часов. День четвертый.

Требования на четвертый день. Процедура. Приготовьте раствор Рингера, 0,9% нормального физиологического раствора и один Х-фосфатный буферный раствор в соответствии с таблицами, представленными в этой рукописи. Затем автоклавируйте три решения.

После автоклава соответствующие растворы могут быть помещены при комнатной температуре. Затем выньте яйцо из инкубатора яиц под углом 37 градусов. Теперь, прежде чем резать оболочку, накройте область окон селлойпом.

А теперь сделайте небольшое отверстие на яичной скорлупе и начните вырезать круглое отверстие. Этот процесс называется окном. Убедитесь, что круговой разрез достаточно большой, чтобы эмбрион мог быть легко доступен с любого направления, так как позиционирование яйцеклетки, возможно, придется скорректировать в соответствии с положением эмбриона.

Теперь, используя хирургический микроскоп со стереозумом, найдите правильную артерию жизненной линии или RVA. Здесь стрелка указывает на трехдневную стадию развития эмбриона. Как только RVA будет найден, с использованием иглы 26 G сделайте два небольших отверстия на левой и правой сторонах RVA.

Затем отрегулируйте допплеровский зонд визуализации кровотока на RVA. Допплеровский зонд для визуализации кровотока должен быть размещен в пяти плюс минус одном миллиметре от места ишемии и двух третей дистального конца RVA. Возьмите показания потока в течение 30 секунд до двух минут, по желанию.

Это сделает нормоксию фазы показаний. Теперь вручную формируйте край спинномозговой иглы, чтобы придать краю форму крючка с помощью плоскогубца для носа, за которым следуют зубные щипцы. Теперь, используя микроманипулятор, вставьте спинномозговую иглу прямо под правую артерию жизненной линии.

Вы готовы поднять спинномозговую иглу. Теперь с помощью микроманипулятора медленно поднимайте артерию до тех пор, пока поток допплеровского кровотока не покажет минимальное снижение артериального потока на 80%. Как только будет достигнуто падение на 80% или более в допплеровском потоке, оставьте спинномозговую иглу поднятой вверх, вытягивая артерию в течение пяти минут.

Это будет период ишемии. После такого ишемического тайминга в пять минут медленно отпустите артерию с помощью микроманипулятора для восстановления нормального уровня кровотока. Теперь допплеровский расходомер крови должен показывать показания, аналогичные тем, которые наблюдаются при нормоксии.

Это будет период реперфузии в RVA. После процесса I/R нанесите на эмбрион две, три капли 1X PBS. Наконец, запечатайте окно с помощью Sellotape, а затем поместите яйцо обратно в инкубатор для яиц на пять часов и 55 минут.

Через пять часов 55 минут выньте яйцо из инкубатора для яиц, поместите на лоток для яиц и снова откройте окно. Требования к лечению. Процедура. Для лечения артерий препаратами, активаторами или ингибиторами RVA следует иссекать после одного часа процесса I/R.

Извлеките эмбрион из оболочки, вынув его из оболочки на стерильную 100-миллиметровую чашку Петри. Как только эмбрион будет выпущен в чашку Петри, иссекните RVA с помощью глазной радужной оболочки под руководством хирургического микроскопа со стереозумом. Размер иссечения RVA должен составлять до 15 плюс минус один миллиметр дистально от ствола и два плюс минус один миллиметр в сторону ствола.

После иссекания RVA вымойте его 1X PBS в новой, стерильной чашке Петри. Для желаемого лечения поместите артерию в стерилизованную 1,5-миллилитровую центрифужную трубку, заполненную 500 микролитрами раствора Рингера. А после помещения артерии в центрифужную трубку поместить в лабораторный инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию на пять часов.

После пяти часов инкубации выньте RVA из лабораторного инкубатора с температурой 37 градусов по Цельсию и приступайте к желаемой обработке. А теперь, чтобы представить результаты. Чтобы проверить полезность нашей модели в исследованиях ишемически-реперфузии в ишемических артериях, сначала мы рассмотрели активность кислородных регуляторных белков 150 или ORP150, цитоплазматической супероксиддисмутазы one или SOD1 и каталазы.

I/R-обработанные RVAs показали повышенную активность ORP150, цитоплазматического SOD1 и каталазы по сравнению с контрольной группой, однако, добавление N-ацетил-L-цистеина или NAC, аквенчера АФК, уменьшало окислительный стресс в группе I/R, что может быть очевидно на текущем рисунке. Чтобы установить полезность этой модели для воспалительных исследований, мы рассмотрели экспрессию I/R-1 бета и TNF-альфа в I/R-обработанных RVAs по сравнению с контрольными RVAs. Было обнаружено, что оба интерлейкина чрезмерно экспрессированы в группе Hook-I/R по сравнению с контрольной группой.

Добавление Нарингенина, противовоспалительного препарата, значительно снизило уровни IL1-бета, а также TNF-альфа. Затем мы изучили экспрессию NLRP3 и NF-kappa beta через вестерн-блоттинг. Этот анализ обнаружил доказательства активации воспалительной NLRP3, а также бета-NF-каппы в ответ на I/R, продуцируемый в RVA.

Подобно предыдущим результатам, нарингенин снижал экспрессию NLRP3 и NF-kappa beta. Эти результаты показали, что наша модель может быть использована для исследования воспалительных изменений. Затем мы изучили влияние I/R на пути апоптоза и аутофагии.

Во-первых, на рисунке А мы получили доступ к выражению расщепленной каспазы-3. Мы наблюдали повышенную экспрессию расщепленной каспазы-3 в группе I/R по сравнению с контрольной группой, в то время как группа I/R, получавшая ZVADFMK, показала снижение экспрессии каспазы-3. Аналогично для аутофагии группа I/R продемонстрировала высокие уровни белка LC3, аутофагосомного маркера Беклина-1, ключевого регулятора аутофагии в клетках млекопитающих, и АТГ-7, белка, необходимого для базальной аутофагии, чем контрольная группа, в то время как группы, получавшие 3-ма, ингибитор аутофагии, показали снижение экспрессии вышеуказанных трех белков аутофагии, Как видно из рисунков B-D.Рисунок E демонстрирует влияние Опосредованного Крючком I/R на уровни мРНК амбры-1 и АТГ-7.

Эти результаты соответствовали предыдущим результатам, то есть наблюдалась повышенная экспрессия мРНК для ambra-1 и ATG-7 в I/R-обработанных RVAs по сравнению с их соответствующими контрольными группами. Однако результаты были обратными, когда 3-ма было добавлено в группу I/R. Текущий рисунок представляет эффективность нашей модели для изучения изменений в ДНК.

Мы наблюдали интенсивный мазок ДНК в группе, получавшей I/R, по сравнению с контрольной группой. Однако добавление NAC в группу I/R RVA изменило результат. Чтобы изучить, насколько эффективна наша модель в отличие от других моделей, мы сравнили данные, сгенерированные нашей моделью Hook-I/R и моделью MCAO в настоящем эксперименте.

Короче говоря, экспрессия апоптотического белка, расщепленной каспазы-3, белков аутофагии, Беклина-1 и АТГ-7, а также воспалительных интерлейкинов, TNF и IFN, была выше в I/R-обработанных RVAs, чем в контрольных RVAs. Интересно, что модель Hook-I/R дала результаты, которые были очень похожи на те, которые были получены моделью MCAO, будь то анализ воспалительного стресса или клеточных путей смерти. Наша модель может быть использована для рутинных экспериментов с ишемией-реперфузией, как отдельно, так и параллельно существующим моделям.

Однако во время имитации ишемии-реперфузии следует принимать самые высокие меры предосторожности при создании отверстий, правой и левой стороны RVA, а также при окклюзии или высвобождении RVA, чтобы он не повредил никаких артерий или вен. В обычной молекулярной биологии, такой как вестерн-блоттинг, анализатор QRT-PCR, химические кислоты и методы визуализации, могут быть импровизированы, чтобы связать патофизиологию, связанную с ишемией-реперфузией за три дня развития эмбриона цыпленка. Эта модель может быть эффективно использована для изучения молекулярной механики на уровнях ДНК, РНК и белка.

Как мы показали вам, при I/R моделировании за три дня развивается эмбрион цыпленка, мы считаем, что наша модель откроет новые возможности в области I/R исследований. В этой работе я желаю вам всего наилучшего в ваших экспериментах. Спасибо.