Высокоскоростной видеомикроскопический анализ для диагностики первой линии первичной цилиарной дискинезии
19 января 2022 г.
Высокоскоростной видеомикроскопический анализ является относительно простым в выполнении, быстрым, экономичным и, в опытных руках, достаточно надежным инструментом для первой линии диагностики первичной цилиарной дискинезии, который должен быть доступен в каждом центре, занимающемся диагностикой и лечением тяжелых заболеваний легких.
Высокоскоростной видеомикроскопический анализ является надежным инструментом для диагностики первой линии первичной цилиарной дискинезии. Эта техника относительно проста в выполнении, быстра, экономична, а в опытных руках еще очень надежный инструмент. И он применим для пациентов всех возрастных групп.
Видеомикроскопия также выявляет вторичную цилиарную функцию. Как, например, из-за бактериальных или вирусных инфекций. Но он в основном использовался для диагностики первичной цилиарной дискинезии.
Ученые используют этот метод также для визуализации внутриклеточных процессов или биологических функций в живых клетках. Помочь мне в этой процедуре будет г-жа Тина Перомаа, наш лаборант.
Перед сбором дыхательных эпителиальных клеток попросите больного тщательно высморкаться. Когда пациент будет готов, держите голову пациента неподвижной одной рукой и используйте межзубную щетку размером 0,6 миллиметра в другой руке, чтобы расчесать нижнюю носовую раковину ноздри, чтобы собрать достаточное количество полосок эпителиальных клеток. Опустите собранные клеточные полоски в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую DMEM, питаемый клетками.
После закрытия крышки микроцентрифуги проведите трубку к источнику света и встряхните трубку, чтобы обнаружить собранные клеточные полоски и конгломераты. Позже поместите микроцентрифужные трубки с правильно закрытыми крышками в полистирольную коробку. Перед плотным закрытием коробки убедитесь, что трубки закреплены внутри коробки.
Затем добавьте холодный пакет в коробку, избегая замораживания образца. После извлечения микроцентрифужных трубок, содержащих образцы, из полистирольной коробки поместите одну трубку под капот нагревательного блока микроскопа, чтобы прогреть до 37 градусов цельсия для высокоскоростного анализа видеомикроскопии или HSVMA. Далее запустите камеру и программное обеспечение видеоблока на компьютере.
Используйте пипетку, чтобы взять небольшой образец и поместить две капли образца в кювету. Накройте кювет крышкой, прежде чем поместить ее под микроскоп. Используйте масляную иммерсионную линзу с 100-кратным увеличением и нанесите каплю погружного масла на поверхность оптики.
Приближаясь к дну тарелки с помощью линзы микроскопа, ищите кластеры клеток без эритроцитов и с низким содержанием слизи. После поиска репрезентативной области интереса, или ROI, сосредоточьтесь на одной группе бьющихся ресничек с наибольшими движениями ресничек и запишите видеоряд. Записывайте клетки с биением ресничек сбоку и сверху.
Репрезентативный анализ показывает нормальные движения ресничек, видимые сбоку и сверху. Образец первичной цилиарной дискинезии, или пациента с ПХД, с мутацией в гене DNAH11 продемонстрировал классический жесткий минимально движущийся паттерн цилиарного биения. При взгляде сбоку и выше.
У другого пациента с ПХД с той же мутацией наблюдалась другая гиперкинетическая, но неэффективная картина биющихся ресничек. Патологический паттерн цилиарного биения и частота цилиарного биения также наблюдались у пациента с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей. Если процедура чистки зубов проводилась строго, анализ HSVMA не мог быть выполнен, так как реснитчатые эпителиальные клетки были покрыты покрытием эритроцитов.
Наиболее важным шагом в процедуре является получение достаточного количества дыхательных клеток из щеток и сохранение этого материала хорошо сохранившимся для видеоанализа. Оставшийся материал может быть использован для выполнения электронной микроскопии или иммунофлоресцентной микроскопии для обнаружения возможных структурных дефектов в ресничках или для выявления дефектов и синтеза цилиарных белков.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Анализ с помощью высокоскоростной видеомикроскопии является надежным и экономически эффективным инструментом диагностики первичной цилиарной дискинезии. Этот метод прост в исполнении и применим для всех возрастных групп, что делает его незаменимым для центров, занимающихся лечением тяжелых заболеваний легких.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Респираторная медицина
- Диагностические методы
Теоретическая часть
- Первичная цилиарная дискинезия — это заболевание, влияющее на функцию ресничек.
- Высокоскоростная видеомикроскопия позволяет выявить как первичную, так и вторичную функцию ресничек.
- Этот метод особенно полезен для диагностики респираторных проблем, связанных с дисфункцией ресничек.
- Для клиницистов крайне важно иметь доступ к надежным диагностическим инструментам.
Цель исследования
- Оценить эффективность высокоскоростной видеомикроскопии в диагностике первичной цилиарной дискинезии.
- Оценить применимость данного метода для различных возрастных групп пациентов.
- Подчеркнуть значимость этого диагностического инструмента в клинических условиях.
Используемые методы
- Анализ с помощью высокоскоростной видеомикроскопии.
- Оценка движения и функции ресничек.
- Сравнение результатов для различных демографических групп пациентов.
- Оценка вторичной функции ресничек в связи с инфекциями.
Основные результаты
- Скоростная видеомикроскопия эффективна для диагностики первичной цилиарной дискинезии.
- Данный метод является надежным при условии его выполнения опытным персоналом.
- Он позволяет получить сведения о вторичной функции ресничек.
- Метод применим к пациентам всех возрастов, что повышает его полезность в клинической практике.
Выводы
- Высокоскоростная видеомикроскопия должна стать стандартным диагностическим инструментом в респираторной медицине.
- Простота использования и надежность делают этот метод подходящим для первичной диагностики.
- Широкая доступность данного метода может улучшить исходы лечения пациентов с тяжелыми заболеваниями легких.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Анализ с помощью высокоскоростной видеомикроскопии (HSVMA) представляет собой быстрый и экономически эффективный метод первичной диагностики первичной цилиарной дискинезии (ПЦД) — редкого генетического заболевания, нарушающего мукоцилиарный клиренс. Обеспечивая прямую визуализацию паттернов биения ресничек в живых клетках респираторного эпителия, HSVMA способствует раннему выявлению заболевания и снижает зависимость от более ресурсозатратных методов, таких как трансмиссионная электронная микроскопия. Эта возможность повышает пропускную способность диагностики в пульмонологических центрах и центрах редких заболеваний, что способствует своевременному медицинскому вмешательству и снижению риска долгосрочных легочных осложнений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проводить функциональную оценку подвижности цилий в клетках, полученных от пациентов, что способствует валидации мишеней в исследованиях цилиопатий.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимый метод анализа для оценки влияния генетических или фармакологических воздействий на функцию цилий.
- Прогностическая ценность: позволяет дифференцировать структурные и функциональные дефекты, повышая достоверность механистических гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные данные о частоте и форме волны биения ресничек для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Способствует разработке стандартизированных протоколов визуализации живых клеток в моделях респираторных заболеваний.
- Масштабируемость: Обеспечивает возможность проведения высококонтентного анализа динамики ресничек для множества образцов пациентов или генетических вариантов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает данные, полученные in vitro, с клиническими фенотипами путем корреляции результатов HSVMA с тяжестью заболевания.
- Механистическое снижение рисков: позволяет выявить функциональное восстановление в доклинических моделях за счет восстановления нормального биения ресничек.
- Согласованность биомаркеров: обеспечивает функциональные показатели, дополняющие структурные или молекулярные биомаркеры при PCD.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
HSVMA вписывается в континуум исследований — от валидации мишени до доклинической оценки, предоставляя функциональный метод анализа для разработки препаратов, воздействующих на реснички.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о генах, участвующих в сборке и подвижности ресничек, таких как DNAH11.
- Скрининг: обеспечивает количественные показания в режиме реального времени, подходящие для скрининга соединений на моделях цилиопатий.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение параметров биения ресничек при различных условиях, что способствует принятию решений на основе данных.
- Трансляционные исследования: связывают клеточные фенотипы с клиническими результатами, помогая в переходе от доклинических к клиническим исследованиям.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для оценки функции ресничек на различных моделях респираторных заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет обеспечения прямой визуализации динамики цилий в естественном клеточном контексте.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря определенным протоколам отбора проб, консервации и визуализации.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) при валидации мишеней путем подтверждения функциональной значимости генетических попаданий.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней цилиопатий с учетом рисков на основе доказательств функционального восстановления.
Особенности реализации
- Требуется опыт в сборе клеток, работе с микроскопом и видеоанализе для точной интерпретации данных.
- Метод зависит от наличия систем высокоскоростной видеомикроскопии с иммерсионными объективами и системой контроля окружающей среды.
- Необходимы стандартизированные процедуры обработки образцов для предотвращения контаминации или деградации.
- Адаптация метода для различных модельных систем может потребовать оптимизации условий культивирования и параметров визуализации.
- Ограничивается необходимостью использования жизнеспособных, незагрязненных образцов эпителия; наличие эритроцитов или слизи может затруднить анализ.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Collection and Transport of Respiratory Epithelial Cells
2:20
High-Speed Video Microscopy Analysis (HSVMA)
3:43
Results: Analysis of Ciliary Motion in Healthy Individual and Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) Patients
4:49
Conclusion
