Индукция воспаления кишечника путем переноса трансгенных CD4+ Т-клеток CBir1 TCR мышам с иммунодефицитом
16 декабря 2021 г.
В этом протоколе описана модель антиген-специфического переноса Т-клеток кишечной микробиоты. CD4+ Т-клетки выделены из трансгенных мышей CBir1 TCR. Они специфичны для иммунодоминантного антигена микробиоты кишечника CBir1 флагеллина, который переносится в реципиента Rag1-/- мышей, что приводит к воспалению кишечника.
Воспалительное заболевание кишечника, или ВЗК, налагает значительное бремя на здоровье и финансовое бремя на отдельных лиц и общество. Эта модель колита полезна для изучения механизмов ВЗК и оценки методов лечения ВЗК. Эта иммунодоминантная модель флагеллина Cbir, специфичная для Т-клеток, дает представление о том, как антиген кишечных бактерий индуцирует ответы Т-клеток, чтобы вызвать колит.
После усыпления мыши сделайте примерно сантиметровый левый разрез живота и оттяните кожу от брюшной мышечной ткани. Затем делают примерно трехсантиметровый разрез в брюшной мышечной ткани. Далее удаляют селезенку стерильными ножницами и щипцами.
Поместите селезенку в культурную посуду, содержащую пять миллилитров предварительно охлажденного промывочного буфера. Измельчите селезенку шероховатой поверхностью двух стерильных стеклянных слайдов. Перенесите клеточную суспензию в 50-миллилитровую центрифужную трубку, проведя ее через 100-микрометровый клеточный сетчатый фильтр.
Промойте стеклянные горки и посуду для культивирования пятью миллилитрами предварительно охлажденного буфера для стирки и переложите буфер стирки в трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию, отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки пятью миллилитрами предварительного буфера лизиса хлорида аммония Tris на селезенку. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
Добавьте в трубку 10 миллилитров предварительно охлажденного промывочного буфера. Затем центрифугируют клеточную суспензию, отбрасывают супернатант и повторно суспендируют клетки 10 миллилитрами предварительно охлажденного изоляционного буфера. Чтобы подсчитать ячейки, тщательно смешайте по 10 микролитров клеточной суспензии и трипанов синего цвета и загрузите 10 микролитров на слайд.
Затем вставьте слайд в автоматический счетчик ячеек, чтобы получить жизнеспособный номер ячейки. Центрифугируйте оставшуюся клеточную суспензию и выбросьте весь супернатант. Вихрь магнитных частиц CD4 против мыши, непосредственно добавьте 50 микролитров частиц на 10 миллионов клеток и тщательно перемешайте с гранулами клеток.
Инкубировать смесь в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите суспензию частиц клетки в стерильную сборную трубку. Добавьте в трубку 3,5 миллилитра предварительно охлажденного изоляционного буфера.
Поместите трубку на магнит разделения ячеек на восемь минут при комнатной температуре. Затем осторожно аспирируйте супернатант трехмиллилитровой переносной пипеткой. Извлеките трубку из магнита разделения ячеек.
Затем повторно суспендируйте ячейки с 3,5 миллилитрами предварительно охлажденного изоляционного буфера и поместите трубку на магнит на четыре минуты при комнатной температуре. Осторожно аспирируйте супернатант трехмиллилитровой пипеткой. Наконец, повторно суспендируйте ячейки в одном миллилитре предварительно охлажденного буфера FACS.
Чтобы перенести клетки мышам-реципиентам, повторно суспендируйте трансгенно-наивные CD4-положительные CD4-положительные Т-клетки Cbir1 до 5 миллионов клеток на миллилитр в 1x PBS. Согрейте мышей под тепловой лампой и удерживайте мышей с помощью мышиного ограничителя. Внутривенно вводят 200 микролитров клеточной суспензии в хвостовую вену мышей.
После усыпления мыши сделайте примерно сантиметровый вентральный разрез средней линии кожи. Оттяните кожу от брюшной мышечной ткани. Затем делают трехсантиметровый разрез в брюшной мышечной ткани.
Далее определите кочевицу и удалите всю толстую кишку стерильными ножницами и щипцами. Смочите толстую кишку предварительно охлажденным ПБС в чашке для культуры. Разрезайте толстую кишку вдоль и промойте ее предварительно охлажденным PBS.
Отрежьте 1/3 толстой кишки продольно. Поместите полоску толстой кишки в бумажное полотенце просветной стороной, обращенной вверх. Выполняйте швейцарскую прокатку с помощью зубочистки.
Поместите двоеточие швейцарцев в кассету и поместите кассету в 10% буферизованный формалин на 24 часа. Обезвоживание и парафин -встраивание толстой кишки с помощью автоматизированного процессора. Затем вырежьте пятимикрометровые участки ткани на микротоме.
Установите ткань на слайды и выполните окрашивание гематоксилином и эозином. Нокаутированные мыши Rag начали терять вес примерно через три недели после клеточного переноса, и их вес достигал от 80 до 85% от их первоначального веса через шесть недель после переноса клеток. Мыши-реципиенты показали короткую длину толстой кишки через шесть недель после переноса клеток.
Мыши-реципиенты продемонстрировали большую инфильтрацию клеток в кишечной lamina propria через четыре недели после переноса клеток. Они показали потерю бокаловидных клеток и гиперплазию эпителиальных клеток кишечника через пять недель после переноса клеток, а также эрозию слизистой оболочки и воспалительную инфильтрацию клеток в подслизистой оболочке толстой кишки через шесть недель после клеточного переноса. Гистопатологические баллы значительно увеличились с четырех до шести недель.
В то же время не было воспаления у нокаутирующих мышей Rag, получавших только PBS. Используя эту процедуру, уровни цитокинов толстой кишки могут быть определены с помощью ИФА и qPCR.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается модель колита, основанная на адаптивном переносе Т-клеток, специфичных к антигенам микробиоты кишечника. CD4 + T-клетки от трансгенных мышей CBir1 TCR переносят мышам Rag1 -/-, что вызывает воспаление кишечника.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Иммунология
- Гастроэнтерология
Введение
- Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) представляют собой серьезную проблему для здравоохранения.
- Данная модель способствует пониманию механизмов развития ВЗК.
- Она позволяет оценивать потенциальные методы лечения ВЗК.
- Представлены данные об ответах Т-клеток на кишечные бактерии.
Цель исследования
- Для разработки модели изучения ВЗК.
- Для исследования ответов Т-клеток на антигены микробиоты кишечника.
- Для оценки терапевтических методов лечения ВЗК.
Используемые методы
- Выделение CD4 + T-клеток из трансгенных мышей.
- Адоптивный перенос T-клеток реципиентам-мышам.
- Индукция воспаления в кишечнике.
- Хирургические процедуры для анализа тканей.
Основные результаты
- Успешная индукция колита у мышей-реципиентов.
- Характеристика Т-клеточного ответа на антигены микробиоты.
- Понимание роли кишечных бактерий в ВЗК.
- Потенциал для оценки терапевтических стратегий.
Выводы
- Данная модель служит платформой для исследования ВЗК.
- Она расширяет понимание иммунных ответов на антигены кишечника.
- В будущих исследованиях эту модель можно использовать для оценки эффективности лечения.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данная модель переноса антигенспецифических Т-клеток позволяет детально изучить механизмы иммунного ответа, индуцируемого микробиотой кишечника при воспалительных заболеваниях кишечника, что способствует валидации мишеней и снижению рисков на доклиническом этапе. Воспроизводя релевантные для человека фенотипы Т-клеток и гистопатологическое прогрессирование, эта модель служит прогностической системой для оценки иммуномодулирующих терапевтических средств. Модель поддерживает рабочие процессы раннего поиска, направленные на выяснение сигнальных путей и подтверждение значимости мишеней в патогенезе ВЗК.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать флагеллин CBir1 как терапевтически значимый антиген микробиоты кишечника в патогенезе ВЗК.
- Практическая ценность: Предоставляет определенную антигенспецифическую систему для выделения и валидации Т-клеточных механизмов кишечного воспаления.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность в выборе мишени, связывая специфические микробные антигены с патогенными Т-клеточными ответами in vivo.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные гистопатологические и клеточные показатели для оценки воздействия соединений на воспаление толстой кишки.
- Практическая ценность: обеспечивает создание воспроизводимого фенотипа колита с измеримой потерей веса, укорочением ободочной кишки и иммунной инфильтрацией для стандартизации анализа.
- Стратегическая ценность: позволяет проводить скрининг иммуномодуляторов с использованием клинически значимых конечных точек, таких как эрозия слизистой оболочки и цитокиновые профили.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Отражает ключевые гистопатологические признаки ВЗК у человека, включая потерю бокаловидных клеток, гиперплазию эпителия и субмукозное воспаление.
- Операционная ценность: Позволяет осуществлять лонгитюдный мониторинг степени тяжести заболевания посредством отслеживания веса, измерения длины ободочной кишки и гистологической оценки для согласования фармакокинетических и фармакодинамических параметров.
- Стратегическая ценность: Облегчает принятие решений о продвижении разработки с учетом рисков путем моделирования хронического Т-клеточного колита, соответствующего патофизиологии болезни Крона.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данная модель интегрируется в рабочие процессы от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая механистический переход от активации антигенспецифических T-клеток к патологии на уровне тканей, что позволяет проводить проверку гипотез и оптимизацию ведущих соединений при ВЗК.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез о роли антигенов микробиоты кишечника и специфичности Т-клеточных рецепторов в развитии воспаления кишечника.
- Скрининг: Предоставляет стандартизированные количественные данные, включая показатели гистопатологии и уровни цитокинов, для оценки соединений.
- Аналитика: Позволяет измерять уровни цитокинов в толстой кишке с помощью ELISA и qPCR для корреляции иммунной активации с терапевтическим ответом.
- Трансляционные исследования: Связывает фенотипы Т-клеток мышей с релевантными для человека механизмами ВЗК через антиген-специфическую иммунопатологию.
- Корпоративное повторное использование: Служит многократно используемой платформой для итерационного тестирования иммуномодулирующих кандидатов, воздействующих на антиген-зависимые пути Т-клеток.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в валидации мишени посредством индукции колита антигенспецифичными T-клетками.
- Практическая ценность: Стандартизированные протоколы индукции и оценки обеспечивают воспроизводимость результатов в различных лабораториях и исследованиях.
- Стратегическая ценность: Снижение биологических рисков за счет валидации мишеней на физиологически релевантной модели антиген-зависимого воспаления.
- Влияние на портфель: Обоснование решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем установления связи между модуляцией мишени и гистопатологическими и клиническими исходами.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области изоляции Т-клеток, магнитного сортинга и методов адаптивного переноса.
- Для точности модели необходим доступ к трансгенным мышам CBir1 TCR и реципиентам с дефицитом Rag1.
- Для согласованной оценки воспаления необходимы стандартизированная гистологическая оценка и обработка тканей.
- Включает хирургические процедуры и перфузию, требующие соблюдения правил асептики и анатомической точности.
- Ограничивается механистическими исследованиями антиген-специфических ответов; не моделирует самостоятельно сложность микробиома или дисфункцию барьера.
