Терминальные измерения H-рефлекса у мышей
16 июня 2022 г.
Клиническая оценка спастичности на основе рефлекса Гофмана (Н-рефлекса) и с использованием электростимуляции периферических нервов является установленным методом. Здесь мы предлагаем протокол терминальной и прямой стимуляции нерва для количественной оценки H-рефлекса в передней лапе мыши.
H-рефлекс позволяет проводить электрофизиологическую проверку целостности нейронных цепей. Мы представляем терминальный протокол для количественной оценки H-рефлекса непосредственно на нервах передней лапы у мышей. В отличие от обычных, довольно нервно-неспецифических чрескожных записей, результаты менее варьируются между мышами и днями измерения.
Подобно записям Н-рефлекса у пациентов, точное количественное определение позволяет проводить электрофизиологические характеристики в моделях заболеваний, например, травмы спинного мозга и инсульта. Протокол требует солидных экспериментальных навыков работы с хирургическим оборудованием у мышей.
Если вы не знаете, как отделить нервы от соединительной ткани и кровеносных сосудов, сначала потренируйтесь. Продемонстрирует процедуру Фредерик Витерс, аспирант из моей лаборатории. Для начала поместите взрослую мышь C57 black/6J в возрасте от 8 до 16 недель на закрытую грелку и подождите, пока мышь не успокоится, дыхание не станет стабильным, а рефлексы отсутствуют.
Переверните мышь на спину. Затем зафиксируйте передние лапы скотчем. Расположите ленту так, чтобы измерительные электроды легко вставлялись в передние лапы.
Для измерения температуры мышью вставьте ректальный зонд и зафиксируйте его скотчем. Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание глаз. Аккуратно удалите мех тонкими закругленными ножницами, приподнимая кожу пинцетом.
Затем сделайте односантиметровый разрез на коже вдоль вентрозадней оси передней лапы парой тонких закругленных ножниц. Осторожно удалите соединительную ткань и обнажив нижнюю мышцу и нерв. Затем удалите обнаженную грудную мышцу с помощью щипцов для оценки срединного нерва.
Удалите небольшое количество крови и тканевой жидкости с помощью мягкой папиросной бумаги. Далее аккуратно разрежьте грудь или подмышечную мышцу сверху вниз, чтобы обнажить нервный пучок. Освободите нервный пучок от соединительной и мышечной ткани длиной примерно 1,5 сантиметра.
Аккуратно отделите локтевой и срединный нерв передней лапы с помощью изогнутой стеклянной пипетки. Верхний нерв - это локтевой нерв, а нижний - срединный нерв. Расположите электроды крючка стимулятора параллельно на расстоянии от 0,5 до одного миллиметра и с помощью микроманипулятора расположите двойной крючок близко к нерву.
Используйте стеклянный крючок, чтобы поднять локтевой нерв на электроды крючка для стимуляции. Затем оттяните электрод с нервом и отделите его от других нервов. Разместите электроды вдоль длинной оси лапы, чтобы уменьшить перекрестные помехи между мышцами.
Поверхностно высушите электродные крючки, прикрепленные к нерву, и нанесите вазелин с помощью шприца, чтобы обеспечить электрическую изоляцию от прилегающих тканей. Чтобы измерить Н-рефлекс, поместите электроды электромиографии внутримышечно в переднюю лапу. Затем поместите электрод сравнения подкожно в заднюю конечность, удерживаемый миниатюрным зажимом из кожи аллигатора.
Когда стимулятор включен, наблюдайте за успешной стимуляцией в виде крошечных подергиваний передней лапы. Минимальный ток стимуляции для вызова М-волны и крошечных видимых подергиваний в передней лапе составляет от 10 до 50 микроампер. Выполните стимуляцию нерва 15 раз импульсами продолжительностью 0,2 миллисекунды каждый.
С паузами в две минуты между наборами стимулов частоту увеличивают с 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 до 5 герц. Здесь показана иллюстрация записи, установленной в путях для измерения рефлекса Хоффмана и мышечной реакции. Оценивалось соотношение амплитуды Н- и М-волны.
Стимул и соответствующий артефакт стимуляции были установлены на ноль миллисекунд, за которыми следовала прямая М-волна и последующий меньший пик, представляющий Н-волну. М-волна возникает примерно через две миллисекунды после стимуляции, а Н-волна — через шесть-восемь миллисекунд из-за более длительного времени прохождения через спинной мозг. Помимо разделения нервов, решающее значение имеет нанесение вазелина на электрод, а также между двумя крючками.
Это окончательный эксперимент. В нашей лаборатории этот метод обеспечил новый золотой стандарт для чрескожных записей Н-рефлекса.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол количественной оценки рефлекса Хоффмана (H-рефлекса) в передней лапе мыши с использованием терминальной и прямой стимуляции нерва. Данный метод является улучшенной версией традиционной транскутанной регистрации, обеспечивая более воспроизводимые результаты для разных животных и в разные дни эксперимента, что призвано облегчить электрофизиологическую характеристику моделей заболеваний, таких как повреждение спинного мозга и инсульт.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Электрофизиология
- Нейробиология
- Моделирование заболеваний
Теоретические основы
- H-рефлекс является общепринятым методом оценки спастичности.
- Целостность нейронных цепей можно оценить электрофизиологически.
- Протокол направлен на снижение вариабельности измерений, связанной с биологическими особенностями мышей.
Используемые методы
- Регистрация H-рефлекса посредством прямой стимуляции нерва
- Мыши (C57 black/6J) в возрасте 8–16 недель
- Электромиография для оценки ответа нерва и мышц
Основные результаты
- Новый терминальный протокол демонстрирует снижение вариабельности по сравнению с традиционными методами.
- Успешная стимуляция привела к наблюдаемым реакциям передней конечности, подтверждающим регистрацию H-рефлекса.
- Ключевые показатели включают соотношение амплитуд H-волны и M-волны.
Выводы
- Данное исследование предлагает надежный метод количественной оценки H-рефлекса в рамках научных исследований.
- Этот протокол может быть использован при изучении неврологических состояний, сопровождающихся спастичностью.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для профильной промышленности
Прямое электрофизиологическое измерение целостности нейронных цепей способствует валидации мишеней в моделях неврологических заболеваний. Протокол терминального H-рефлекса снижает вариабельность при оценке спастичности, повышая прогностическую достоверность трансляционных исследований. Это позволяет принимать более надежные решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) в рамках доклинических портфелей исследований повреждений спинного мозга и инсульта.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки целостности путей спинальных рефлексов.
- Практическая ценность: обеспечивает биологическую минимизацию рисков за счет прямых измерений при стимуляции нервов.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля исследований путем выявления моделей заболеваний с электрофизиологическими фенотипами спастичности.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает стандартизированные измерения H-рефлекса с низкой вариабельностью между мышами и экспериментальными днями.
- Количественные данные: позволяет рассчитывать соотношение амплитуд H-волны к M-волне для объективной оценки спастичности.
- Повторное использование платформы: адаптируема для локтевого, срединного, большеберцового и седалищного нервов при внесении незначительных модификаций.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболевания: Моделирует спастичность после инсульта посредством усиления H-рефлекса, что коррелирует с гипертонусом и непроизвольными сокращениями.
- Трансляционная преемственность: Отражает результаты регистрации H-рефлекса у пациентов в клинических условиях, что позволяет проводить валидацию на разных видах.
- Обоснованное снижение рисков: Способствует механистическому снижению рисков путем подтверждения взаимодействия с мишенью в спинальных путях.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум исследований — от валидации мишени до доклинического тестирования эффективности на моделях неврологических заболеваний.
- Биология открытий: Проверка уточнения путей посредством изоляции вклада спинномозговых рефлексов в мышечный ответ.
- Скрининг: Обеспечение воспроизводимости анализа путем прямой стимуляции нерва и изоляции вазелином.
- Аналитика: Предоставление отношения H-волны к M-волне в качестве количественного показателя для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Соответствие клиническим биомаркерам спастичности через электрофизиологическую гомологию.
- Корпоративное повторное использование: Создание эталонного стандарта для электрофизиологической валидации в различных лабораториях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет снижения вариабельности измерений при оценке целостности нейронных цепей.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость результатов между субъектами и в разные дни измерений.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя раньше выявлять мишени, не подлежащие трансляции.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации соединений с учетом рисков на основе электрофизиологической валидации мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения хирургических операций на мышах, диссекции нервов и электрофизиологической регистрации.
- Необходимы высокоточные инструменты, включая микроманипуляторы, стимуляторы и усилители ЭМГ.
- Требуется стандартизация методов изоляции нервов и размещения электродов между всеми участниками исследования.
- При применении протокола к нервам задней лапы необходимо учитывать особенности адаптации метода.
- Метод ограничен своим терминальным характером, что исключает возможность проведения лонгитюдных исследований на одном и том же животном.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:15
Preparation
1:53
Surgery
2:54
Electrode Placement
3:34
Placement of the Recording and Reference Electrodes and Measurement
4:25
Results: Terminal H-Reflex Quantification at the Ulnar and Median Nerves of the Mouse Forepaw
5:04
Conclusion
