Регистрация переходных процессов кальция в нервно-мышечном соединении мыши с высоким временным разрешением с помощью конфокальной микроскопии
1 декабря 2021 г.
Протокол описывает способ загрузки флуоресцентного кальциевого красителя через разрезанный нерв в мышиные двигательные нервные окончания. Кроме того, представлен уникальный метод регистрации быстрых переходных процессов кальция в периферических нервных окончаниях с помощью конфокальной микроскопии.
Оценка пресинаптического уровня кальция является ключевой задачей в изучении синаптической передачи. Изучение передачи сигналов кальция также важно для поиска способов лечения нейродегенеративных заболеваний. Основным преимуществом представленной методики загрузки является то, что окрашивание выполнено только для интересующих клеток.
Наш метод регистрации непримиримости кальция обеспечивает чрезвычайно хорошее пространственно-временное разрешение. Представленный метод регистрации может быть полезен нейрофизиологам, которым необходимо регистрировать быстрые периодические процессы с помощью конфокального микроскопа. Самым сложным этапом в технике загрузки является удержание нерва внутри пипетки.
Диаметр пипетки должен идеально подходить, поэтому сделайте несколько. Знание всех шагов в протоколе сложны и демонстрация каждого из них очень поможет. Начните с фиксации мышечной ткани levator auris longus слегка растянутым образом в чашке Петри, покрытой эластомером, тонкими штифтами из нержавеющей стали и добавьте раствор Рингера в блюдо до тех пор, пока мышца не будет полностью покрыта.
Затем используйте съемник микропипетки, чтобы подготовить микропипетку с тонким острым наконечником для внутриклеточных записей. Используйте капилляры без внутренних нитей. Забив конус абразивом, отломите наконечник микропипетки, оставив наконечник открытым примерно до 100 микрометров в диаметре.
Затем отполируйте наконечник огнем до тех пор, пока внутренний диаметр не уменьшится с 80 микрометров до 12 микрометров. Когда все будет готово, прикрепите силиконовую трубку к одной стороне и шприц без иглы к другой стороне пломбировочной пипетки. Под стереомикроскопом найдите, где нервный ствол превращается в отдельные нервные ветви.
Поместите начиночную пипетку на чашку Петри с помощью воска, а затем переместите кончик пипетки, пока он не встанет над нервом. Разрежьте нерв близко к мышечному волокну тонкими ножницами, оставив небольшой кусочек культи нерва, длиной около одного миллиметра. Затем аспирируйте культю нерва каким-нибудь раствором Рингера в кончик пломбировочной пипетки, не защемляя нерв.
После этого снимите силиконовую трубку с пломбировочной пипетки. Позже используйте шприц с длинной нитью, чтобы нарисовать раствор для загрузки красителя. Затем вводят наконечник нити с загрузочным раствором в пломбировочную пипетку и выпускают смесь на культю нерва с последующим инкубированием нервного препарата при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
После инкубации промыть нервный препарат свежим раствором Рингера, прежде чем обрабатывать его 50 миллилитрами раствора Рингера в стеклянном стакане при 25 градусах Цельсия в течение двух часов. Для конфокальной микроскопии установите нервный препарат в экспериментальную камеру, покрытую кремниевым эластомером, и зафиксируйте ее, слегка растянутую, с помощью набора стальных микроигл. Затем тщательно промойте препарат раствором Рингера.
Установите всасывающий электрод на камеру. После установки подготовительной камеры на ступень микроскопа поместите впускные и выпускные фитинги в камеру. Включите систему с гравитационным потоком, чтобы удалить лишний раствор из препарата.
После этого подключите стимулирующий всасывающий электрод к электрическому стимулятору и убедитесь, что мышечные сокращения происходят после стимулов. Затем заполните перфузионную систему раствором Рингера, содержащим 10 микромолярного d-тубокурарина, и включите перфузионный всасывающий насос, чтобы начать перфузию. В лазерном сканирующем конфокальном микроскопе или программном обеспечении LSCM выберите электрофизиологию и режим сбора для установки параметров визуализации.
В настройках меню заданий выберите настройки триггера для запуска стимулятора с синхронизирующим импульсом микроскопа и установите триггер на поле кадра на канал OUT 1. Включите режим сканирования в XYT на частоте сканирования 1,400 герц. Коэффициент масштабирования должен быть 6,1 при полностью открытом отверстии.
Убедитесь, что включен последовательный, транспассионный, двунаправленный режим X, затем установите минимальное время для формирования кадра в 52 миллисекунды и сбора кадров в необработанное видео через 20 кадров. Установите длину волны возбуждения аргонового лазера на уровне 488 нанометров при 8% выходной мощности. Когда параметры установлены, нажмите кнопку режима реального времени, чтобы получить предварительный просмотр нервных окончаний, загруженных красителем.
В режиме реального времени найдите интересующий регион или рентабельность инвестиций, чтобы получить наилучший фокус. Затем сдвиньте задержку на стимуляторе на две миллисекунды меньше относительно предыдущего значения и запустите программное обеспечение для сбора данных, чтобы получить 26 последовательностей, сместив каждую последовательность на две миллисекунды от предыдущей. Чтобы обработать захваченные видео, запустите программное обеспечение Leica Application Suite X или LAS X и откройте созданный проект.
Затем нажмите «Экспорт» и сохраните как сохранить кадры в формате TIF в папке назначения. Затем запустите программное обеспечение ImageJ и нажмите на файл, импорт и последовательность изображений. В окне открытия последовательности изображений выберите папку назначения и откройте первый кадр.
В параметрах последовательности перейдите к начальному полю изображения и установите номер кадра равным единице для первого кадра. Затем в поле приращения установите значение, равное количеству кадров в начальной записи сигнала, прежде чем нажать кнопку «ОК». Чтобы сохранить сгенерированный файл сшитых первых кадров в отдельную папку, нажмите на вкладки файл, сохранить и папку по порядку.
Повторите процедуры для 19 кадров, установив соответствующий номер кадра в поле начального изображения. Когда все изображения будут получены, нажмите на файл, импорт и последовательность изображений, чтобы выбрать один в начальных полях изображения и инкремента. Можно увидеть финальное видео со всеми кадрами, сшитыми вместе с увеличенным временным разрешением.
Затем сохраните видеофайл в формате TIF. Чтобы проанализировать сшитое видео, нажмите на изображение, стеки, инструменты и сортировщик стеков. Затем перейдите к анализу, инструментам и менеджеру ROI.
Перетащите TIF-файл, сохраненный ранее, в окно ImageJ, а затем разверните изображение для лучшего просмотра. Чтобы улучшить визуализацию изображения, нажмите на изображение, отрегулируйте, чтобы включить контраст яркости в авто. Установите фон близко к нервному терминалу, нарисовав ROI и добавив ценность менеджеру ROI.
Затем рассчитайте фон, нажав на more и multi measure. Скопируйте средние значения для вставки в программу для работы с электронными таблицами. Затем рассчитайте среднее значение.
Затем вычтите вычисляемое среднее значение из стеков, щелкнув процесс, основной и вычтите. Введите полученное значение и нарисуйте ROI вокруг нервного терминала через полигональную линию, прежде чем добавлять его в менеджер ROI. Измерьте переходную интенсивность нервного терминала, щелкнув больше и несколько измеряя вкладки.
Затем скопируйте средние значения интенсивности и вставьте их в программу для работы с электронными таблицами, чтобы рассчитать среднее смещение сигналов. Разделите значения сигнала на среднее значение смещения. Из полученного значения вычтите единицу, а затем умножьте на 100%, а затем постройте график переходных процессов кальция для определения амплитуды.
После загрузки нервного препарата красителем большая часть синапса располагается близко к культе нерва, указывается достаточный уровень флуоресценции. После обработки изображения была получена теплотечная передача кальция с требуемым пространственным и временным разрешением. Одним из наиболее важных шагов в этом протоколе является то, что культя нерва должна быть помещена в краситель, содержащий раствор, в первые несколько минут после разрезания нерва.
Этот метод может быть использован для загрузки различных красителей и лекарств в двигательные нейроны. Протокол регистрации может быть полезен для оценки кальция в дендритах и шипах в препаратах ЦНС. Наша методика позволяет регистрировать кальциевый сигнал с хорошим пространственным и временным разрешением.
Изучение быстротечности кальция является мощным инструментом в исследованиях регуляции высвобождения нейротрансмиттера и синаптической пластичности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод введения флуоресцентного кальциевого красителя в терминали двигательных нервов мыши, а также уникальный метод регистрации быстрых кальциевых транзиентов в окончаниях периферических нервов с помощью конфокальной микроскопии. Исследование сосредоточено на оценке уровней пресинаптического кальция для более глубокого понимания синаптической передачи, что имеет решающее значение для разработки методов терапии нейродегенеративных заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейрофизиология
- Кальциевая сигнализация
- Синаптическая передача
Теоретические основы
- Необходимость оценки уровней пресинаптического кальция при изучении синаптической передачи.
- Роль кальциевой сигнализации в лечении нейродегенеративных заболеваний.
- Сложность проведения точных внутриклеточных записей с терминалей двигательных нервов мыши.
Цель исследования
- Продемонстрировать эффективный метод внутриклеточного введения кальциевого красителя в нервные окончания.
- Представить методику регистрации кальциевых транзиентов с высоким пространственно-временным разрешением.
Используемые методы
- Основной платформой, используемой для регистрации данных визуализации, является конфокальная микроскопия.
- В качестве биологической модели использовались двигательные нервные терминали мыши.
- Критически важными этапами являются методы использования микропипеток, включающие их точное изготовление и манипуляции вокруг нерва.
- Подготовка нерва включает специальные процедуры обработки, в том числе введение раствора Рингера и инкубацию.
Основные результаты
- Используемая техника введения позволяет эффективно окрашивать только интересующие клетки.
- Было достигнуто высокое пространственно-временное разрешение при регистрации кальциевых транзиентов в нервных терминалях.
- Метод демонстрирует потенциал для регистрации быстрых периодических процессов, имеющих значение для нейрофизиологии.
Выводы
- Данное исследование представляет ценный протокол для изучения динамики кальция в пресинаптических терминалях.
- Полученные результаты имеют важное значение для понимания нейрональных механизмов, предлагая новые сведения о процессах синаптической передачи.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Регистрация пресинаптических кальциевых транзиентов в нервно-мышечном соединении с высоким разрешением позволяет точно исследовать механизмы синаптической передачи, что способствует валидации мишеней на ранних этапах нейробиологических исследований. Эта возможность повышает прогностическую достоверность анализа путей и позволяет принимать обоснованные решения с учетом рисков при формировании портфелей исследований нейродегенеративных заболеваний. Пространственно-временная точность данного метода делает его ценным ресурсом для механистического снижения рисков и обеспечения трансляционной преемственности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает количественную оценку пресинаптической динамики кальция, что критически важно для валидации мишеней нейротрансмиссии.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет уточнения временной последовательности кальций-зависимых синаптических событий.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней посредством прямого измерения вызванного стимулом притока кальция.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную систему для получения изображений кальциевых транзиентов с высоким разрешением в определенных популяциях нейронов.
- Обеспечивает воспроизводимую количественную оценку кальциевых ответов, что способствует стандартизации анализа и оптимизации рабочих процессов последующего скрининга.
- Позволяет получать количественные данные, подходящие для сравнительного анализа фармакологических или генетических воздействий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний, позволяя оценивать механизмы синаптической пластичности, участвующие в нейродегенерации.
- Способствует разработке трансляционных биомаркеров за счет прямого измерения функциональных конечных точек синапсов.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации, предоставляя надежные количественные показатели.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод кальциевого имиджинга на базе конфокальной микроскопии интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, связывая механистические исследования и трансляционную нейробиологию.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о регуляции кальция в пресинаптических окончаниях и механизмах высвобождения нейромедиаторов.
- Скрининг: обеспечивает готовую к применению, воспроизводимую визуализацию кальциевых транзиентов для скрининга соединений или генетических модификаций.
- Аналитика: позволяет количественно определять амплитуду, кинетику и базовые уровни кальция для проведения надежного статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: связывает результаты изучения механизмов с моделями синаптической дисфункции, имеющими клиническое значение.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный рабочий процесс, адаптируемый к различным препаратам нейронов и различным экспериментальным задачам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации синаптических мишеней и проведении механистических исследований.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы визуализации для внедрения в различных исследовательских группах.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах в портфелях препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию синаптических мишеней и путей с учетом рисков для дальнейшего продвижения.
Особенности реализации
- Требуются навыки конфокальной микроскопии и методы прецизионной работы с нервами.
- Необходим доступ к платформам высокоскоростной визуализации и современному программному обеспечению для анализа изображений.
- Требуется строгая стандартизация параметров загрузки красителя и визуализации между всеми исследовательскими группами.
- Методика может быть адаптирована для других нейрональных систем при условии оптимизации протокола с учетом совместимости тканей и красителей.
- Результат зависит от сохранения жизнеспособности нерва и точного соблюдения временных интервалов при нанесении красителя и проведении визуализации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:12
Dye Loading Procedure
3:28
Video Capture with Confocal Microscopy
6:14
Video Processing
7:56
Video Analysis
9:55
Results: Mouse Nerve Terminals Loaded with the Ca2+ Indicator and Representative Trace of Calcium Signal
10:18
Conclusion
