Готовая к использованию qPCR для обнаружения ДНК из Trypanosoma cruzi или других патогенных организмов

Протокол гелеобразования производит готовые к использованию реакции qPCR, которые уменьшают время и шаги, необходимые для начала запуска. Этот протокол позволяет производить и контролировать реакции qPCR для качества и больших количеств одновременно, уменьшая вероятность ошибки оператора во время расчетов рецептуры или аликвотирования в скважины. Этот метод может быть применен к любой qPCR, которая уже полностью оптимизирована в обычном замороженном формате.

Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что два основных этапа контроля качества являются визуальными. Чтобы приготовить раствор мелезитозы, взвесьте четыре грамма мелезитозы в пластиковой трубке объемом 15 миллилитров, добавьте шесть миллилитров воды, свободной от нуклеазы, и вихрь на максимальной скорости, пока порошок не будет солюбилизирован. Сделайте окончательный объем до 10 миллилитров водой без нуклеазы, затем нанесите метку и храните раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение шести месяцев.

Чтобы приготовить раствор трегалозы, взвесьте четыре грамма трегалозы в пластиковой трубке объемом 15 миллилитров, добавьте шесть миллилитров воды, свободной от нуклеазы, и вихрь на максимальной скорости, пока порошок не будет солюбилизирован. Затем восполните объем до 10 миллилитров водой без нуклеаз и процедите раствор через фильтр 0,2 микрона. Маркируйте и храните раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение шести месяцев.

Чтобы приготовить раствор гликогена, взвесьте два грамма гликогена в 15-миллилитровой трубке, добавьте шесть миллилитров воды, свободной от нуклеазы, и вихрь до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован. Держите раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение восьми-12 часов, потому что солюбилизация гликогена производит много пузырьков. На следующий день, удалив раствор из инкубации, восполняют объем до 10 миллилитров безнуклеазной водой и хранят меченый раствор при двух-восьми градусах Цельсия до шести месяцев.

Чтобы приготовить раствор лизина, взвесьте 7,5 миллиграммов лизина в 15-миллилитровой пробирке, добавьте шесть миллилитров воды без нуклеазы и вихрь до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован. Восполнить объем до 10 миллилитров водой без нуклеазы. Отфильтруйте раствор через 0,2-микронный фильтр и храните при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение шести месяцев.

Для приготовления гелеобразующей смеси смешайте соответствующие объемы бульонных растворов в пластиковой тубе объемом 50 миллилитров. Смешайте реагенты, перевернув трубку 10 раз, и храните меченый раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение трех месяцев. Чтобы приготовить мастер-микс qPCR для гелеобразования, разморозьте реагенты в рефрижераторном контейнере.

Затем смешайте соответствующие объемы реагентов в трубке объемом 1,5 миллилитра, чтобы приготовить достаточное количество основной смеси для полосы из восьми трубок или пластины из 96 лунок. Далее пипетка 18,5 микролитров мастер-гелеобразования смешивается на каждую реакционную скважину и помещает трубки или пластину в теплопроводящую опору внутри вакуумной печи. Если вы используете 96 плит скважины, поместите один мешок бентонитовой глины в печь на каждые две 96 плит скважины для поглощения воды.

Когда цикл завершен, проверьте трубки или пластины на правильное гелеобразование реагентов, убедившись, что объем заметно уменьшается примерно до пяти микролитров и жидкости не перемещаются при постукивании по трубкам или пластинам пальцами. Запечатайте и храните трубки или пластины при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение восьми-12 часов перед использованием. Чтобы использовать гелеобразную qPCR, извлеките полоску или пластину из холодильника и откройте ее на рабочем месте для обработки образцов.

Добавьте 15 микролитров воды без нуклеазы и пять микролитров образца ДНК в каждый реакционный сосуд. Запечатайте трубки или пластины, проведите нужный эксперимент и выполните регулярный анализ данных. В настоящем протоколе температура внутри камеры поддерживается постоянной на уровне 30 градусов цельсия, в то время как давление колеблется от 910 до 930 миллибар и около вакуума.

После вакуумного цикла мастер-микс внутри трубки уменьшается в объеме, становится гелеобразной на дне и не брызгает на стенки при постукивании трубок. Если гелеобразование неполное, жидкость разбрызгивается на стенки трубки, когда трубки постукиваются. Обнаружение ТРИПАНОСОМА КРУЗ-ДНК с использованием опубликованных олигонуклеотидных последовательностей показано здесь.

Обнаружение того же образца, когда гелеобразование было выполнено неправильно, приводило к потере чувствительности. Наиболее важным этапом является расчет объема реагентов перед гелеобразованием. Оператор должен помнить о том, чтобы не добавлять воду, так как она будет удалена во время процесса.

Если шаги протокола будут тщательно соблюдаться, операторы с базовыми лабораторными и молекулярными биологическими навыками не будут испытывать трудностей с выполнением процесса гелеобразования.