Продольная прижизненная микроскопия с использованием окна визуализации молочной железы со сменной крышкой

Молочная железа очень динамична и подвергается множественным раундам ремоделирования на протяжении всей жизни. Наш протокол позволяет фиксировать клеточную динамику, приводящую к перестройке тканей в здоровой и больной молочной железе. Наше окно визуализации молочных желез со сменной крышкой позволяет выполнять продольную прижизненную визуализацию молочной железы в течение длительных периодов времени, до нескольких недель.

Сменная крышка окна визуализации молочной железы обеспечивает оптимальные условия визуализации в любое время и позволяет манипулировать тканями или вводить лекарства в перерывах между сеансами визуализации. Наш метод не только дает представление о биологии здоровой молочной железы, но и позволяет изучать инициацию и прогрессирование опухоли молочной железы на одноклеточном уровне. Начните с размещения крышки окна визуализации молочной железы на стерильной поверхности и нанесения цианоакрилатного клеевого клея по всему периметру крышки обода.

Аккуратно поместите 10-миллиметровую круглую стеклянную крышку поверх крышки. Используйте стерильную деревянную палку, чтобы расположить стеклянную крышку и приложить некоторую силу, чтобы толкнуть ее вниз, чтобы обеспечить герметичное уплотнение между проскальзыванием стеклянной крышки и рамой крышки. Убедитесь, что стекло не закрывает отверстия в рукавах крышки.

Продезинфицируйте крышки и окно визуализации молочной железы, погрузив их в 80% этанол на срок не менее 30 минут в закрытую чашку Петри. Используйте хлопчатобумажный наконечник, пропитанный ацетоном, чтобы удалить избыток цианоакрилатного клея на стеклянной крышке. Чтобы подготовить мышь к операции, побрейте область вокруг четвертой молочной железы с помощью лезвия бритвы.

Используйте четвертый сосок в качестве ориентира и удалите распущенные волоски с помощью липкой ленты. Выполните тест на изъятие лапы, чтобы проверить, адекватно ли животное обезболено. Осторожно поднимите кожу с помощью тонких щипцов Graefe и используйте небольшие пружинные ножницы, чтобы сделать разрез по диагонали от 10 до 15 миллиметров в коже поверх четвертой жировой прокладки молочной железы Используйте четвертый сосок в качестве ориентировочной точки и убедитесь, что вы не разрезаете и не повреждаете брюшину или молочную железу.

Отделите кожу от жировой прокладки молочной железы и нижележащих слоев тканей, используя тупое рассечение до пяти-восьми миллиметров по всей линии разреза, чтобы создать карман, соответствующий оконной раме для визуализации молочной железы. Определите интересующую область, или ROI, на основе макроскопических особенностей ткани молочной железы, включая расположение лимфатического узла или опухолевого поражения. Старайтесь держать ROI центральным в отношении разреза.

Возьмите окно визуализации молочной железы с помощью стерильных щипцов и проверьте, достаточно ли велик разрез, чтобы вставить окно. При необходимости слегка увеличьте разрез до тех пор, пока не впишется окно визуализации молочной железы. Снимите окно и используйте шелковый шов 5-0, чтобы поместить шов из нити кошелька на расстоянии одного-двух миллиметров от края разреза, начиная с каудального конца и снаружи до внутренней части кожи.

Двигайтесь примерно на пять миллиметров вверх вдоль разреза и пропустите шовную нить через кожу изнутри наружу. Повторите эту процедуру по краю разреза, тем самым создав круговой шов, состоящий из пяти-шести петель. Окончательный выход шовной нити должен располагаться примерно в двух-пяти миллиметрах от первого входа.

Поместите окно визуализации молочной железы внутрь разреза и используйте щипцы Graefe, чтобы аккуратно поместить кожу в канавку окна. Обязательно оставьте петли шва снаружи. Потяните петли шва кошелька и аккуратно потяните оба конца шва, чтобы затянуть его в паз окна визуализации молочной железы.

Завяжите хирургическими узлами и отрежьте лишнюю нить. Используйте зубочистку, чтобы нанести вазелин на внутренний край окна, избегая подлежащей ткани. Осторожно надавите на оконную раму вниз стерильными щипцами и поместите крышку в оконную раму.

Это позволит избежать объема воздуха между тканью молочной железы и крышкой окна визуализации молочной железы. Поместите кончики тонких щипцов через отверстия в плечах крышки и затяните крышку, скручив ее по часовой стрелке. Если после затягивания крышки остается немного воздуха, введите стерильную инсулиновую иглу через кожу в полость между тканью молочной железы и крышкой и медленно вытащите поршень, тем самым создав вакуум между тканью молочной железы и веком окна визуализации молочной железы.

Теперь лимфатический узел можно легко наблюдать после этой процедуры. Осмотрите состояние оконной рамы молочной железы и крышки, включая стабильность швов или любое потенциальное повреждение крышки. Расположите мышь на инкрустации таким образом, чтобы окно визуализации молочной железы попадало в отверстие инкрустации коробки изображений.

Нанесите полупрозрачную и бумажную ленту на заднюю часть мыши, чтобы стабилизировать мышь и уменьшить движение тканей из-за дыхания. Для сеансов визуализации более трех часов поместите гибкую иглу подкожно в шею мыши и закрепите ее бумажной лентой. Прикрепите 10-миллиметровый шприц с питательной смесью к гибкой силиконовой трубке и толкайте питательную смесь, пока она не достигнет конца трубки.

Подключите силиконовую трубку к гибкой игле и вводите 50 микролитров инфузионного раствора каждые 30 минут. Поместите крышку над коробкой для обработки изображений, чтобы закрыть ее. Затем закрепите коробку визуализации на стадии микроскопа.

Убедитесь, что мышь стабильна внутри окна обработки изображений. Определите интересующую область с помощью режима эпифлуоресценции микроскопа и примените настройки микроскопа. Используйте функцию Спираль в режиме навигатора программного обеспечения для визуализации, чтобы создать большое обзорное сканирование плитки и создать эталонную карту ткани.

Определите область интересов в обзоре Spiral, а затем определите верхнюю и нижнюю плоскости Z, чтобы определить стек Z. Нажмите Start, чтобы получить подробные трехмерные или четырехмерные Z-стеки ткани. Поместите кончики тонких щипцов через отверстия для молочных окон в руках крышки и ослабьте крышку, скручив против часовой стрелки.

Альтернативно, ткань может быть обработана или перемещена с использованием стерильных тупых щипцов для оптимизации условий визуализации для конкретной области интереса. Нанесите вазелин на внутренний край окна визуализации молочной железы, избегая подлежащей ткани. Осторожно надавите на оконную раму вниз стерильными щипцами и поместите крышку в оконную раму.

Наконец, поместите кончики тонких щипцов через отверстия плеч крышки и осветлите крышку, закрутив ее по часовой стрелке. Пубертатным мышам Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26 с томатной мембраной GFP вводили низкую дозу тамоксифена, что приводило к cre-опосредованной рекомбинации аллеля GFP Rosa26-мембраны томатной мембраны. Мыши были сфотографированы на первый, третий и пятый дни, чтобы следить за динамическими изменениями в развивающейся молочной железе.

Репрезентативные изображения показывают 3D-рендеринг удлиненного и ветвящегося молочного протока в течение нескольких дней, изображенного через окно визуализации молочной железы. Здесь показаны одиночные изображения Z-плоскости ветвящегося кончика и удлиняющейся ветви. Одиночные клетки в строме выделены белыми звездочками.

Репрезентативные изображения показывают паховый лимфатический узел мыши, изображенный через окно визуализации молочной железы. Второе поколение гармоник изображено зеленым цветом. Здесь показаны 3D-визуализации структуры протоков молочной железы взрослой самки E-кадгериновой мембраны CFP мыши в течение нескольких последовательных дней.

Коллагеновый паттерн I использовался для отслеживания той же рентабельности инвестиций, а сигнал CFP мембраны E-кадгерина использовался для маркировки клеток протоков. Зелено-красные мыши Кикумэ были сфотографированы на нулевом дне до и после воздействия фиолетового света. Сеансы визуализации повторялись на второй, шестой и 10-й день после преобразования.

Та же область молочной железы была изображена через окно визуализации молочной железы в течение 10 дней. Меньшие области были преобразованы в нулевой день и показали аналогичную скорость разбавления красного сигнала Кикумэ с течением времени, что указывает на равную скорость оборота по всему эпителию. Зум-изображения указанных областей показывают пролиферативную гетерогенность на клеточном уровне через шесть и 10 дней после фотопреобразования.

Количественная оценка соотношения красного и зеленого различных клеток через 10 дней после фотоконверсии выявила весьма изменчивые скорости разбавления некоторых клеток в пределах одного и того же микроокального микроокружения. Важным этапом этой процедуры является открытие крышки между сеансами визуализации. Эта уникальная особенность окна улучшает условия визуализации и позволяет проводить продольную визуализацию ткани.

Окно визуализации молочной железы со сменной крышкой облегчит новые вопросы, касающиеся in vivo, быстродействующего тестирования лекарств и скрининга в области инициирования и прогрессирования опухоли в молочной железе мыши.