Использование 2-фотонной микроскопии для количественной оценки влияния хронической односторонней обструкции мочеточника на клубочковые процессы

Данные, представленные в этом исследовании, показывают драматические последствия односторонней обструкции мочеточника на функцию почек, воспаление и фиброз. Это помогает нам понять патофизиологические механизмы односторонней обструкции мочеточника. Основным преимуществом этого метода является способность изучать клеточно-клеточные взаимодействия, субклеточные события и динамически связывать структуру и функцию в функционирующей почке.

Демонстрация мочеточниковой процедуры будет сделана доктором Сильвией Кампос-Бильдербек, которая является хирургом в нашей лаборатории. Для начала обезболивайте крысу, затем сделайте разрез вдоль средней линии и найдите левую почку, чтобы отделить ее от окружающих брюшиных органов. После локализации почечной ножки, включающей почечную артерию, почечную вену и мочеточник, отделите мочеточник, не повреждая деликатную структуру.

Используйте щипцы, чтобы зациклить и завязать 3-0 шов вокруг мочеточника, затем завяжите узел на несколько миллиметров по обе стороны от первого узла, чтобы обеспечить полную обструкцию. Как только мочеточник будет перевязан, аккуратно закройте последовательные мышечные слои, затем полностью закройте живот. Закройте внешнюю кожу хирургическими скобами.

Для хирургической подготовки поместите анестезированную крысу с внутренней венозной линией доступа на бок с выбритым левым боком лицом вверх плоско и прямо на столе. Убедитесь, что передние лапы крысы касаются друг друга, как и задние лапы. Как только крыса будет позиционирована, пальпируйте левый бок чуть ниже ребер, чтобы пощупать почку и определить естественное положение в брюшной полости, затем проведите линию, используя постоянный маркер вдоль бритой области, разделив центр почек пополам в ориентации нос к хвосту.

Используйте пару зубчатых щипцов, чтобы схватить и поднять кожу вверх и зажать постоянную маркерную линию с помощью пары гемостатов, чтобы раздавить подлежащую сосудистую систему и предотвратить кровотечение. Повторите процедуру для тонкого наружного мышечного слоя, чтобы свести к минимуму кровотечение. Чтобы сделать окончательный разрез тонкого внутреннего мышечного слоя брюшной полости, прощупайте почку, чтобы оценить размер и положение, и поднимите внутренний мышечный слой парой щипцов, затем раздавите линию, которая делит кожу пополам над почкой с помощью гемостатов, что составляет примерно 1/3 предполагаемого размера почки.

Сохраняя захват мышечного слоя щипцами, сделайте окончательный разрез. Затем используйте щипцы в каждой руке, чтобы захватить и удерживать почечный жир на нижнем полюсе почки с техникой «рука-через руку», работающей вниз. Крепко схватив жир одной рукой, потяните жир и очень аккуратно сожмите почку через разрез.

Если почка не проходит насквозь, легко расширяйте разрез. Чтобы идентифицировать белые кровяные клетки или лейкоциты, застрявшие в капиллярных петлях, вводят ядерное пятно Hoechst 33342 со скоростью 8 микрограммов на килограмм веса крысы через внутреннюю венозную линию доступа. На микроскоп поместите открытую почку к краю чашки с небольшим вращением, чтобы брюшная сторона почки соприкасалась с крышкой, а спинная сторона была обращена в сторону от края.

Чтобы еще больше свести к минимуму движение, упакуйте две стерильные марлевые подушечки 2 на 2, смоченные физиологическим раствором против спинной стороны почки, усиливая контакт брюшной стороны почки с краем. Когда образец позиционируется, посмотрите через окуляр микроскопа при эпифлуоресцентном освещении с помощью двухпроходного кубика родамина FITC. Если движение обнаружено в положении образца, внесите незначительные коррективы, отрегулировав марлю, гарантируя, что она не проталкивается под почку.

Слегка переверните крысу, чтобы грудная клетка была дальше от тарелки. Сканируйте поверхность почки с помощью эпифлуоресцентного освещения и отмечайте положения клубочков с помощью программного обеспечения, связанного с моторизованным контроллером стадии. Для каждого цветового канала под 2-фотонной подсветкой возьмите неглубокий 3D-объем верхней части каждого отмеченного клубочка, чтобы служить фоновым изображением.

В опции отображения программного обеспечения для визуализации используйте псевдоцветную палитру для визуализации слабых интенсивностей фоновой флуоресценции клубочковых капиллярных петель. Используя поверхностный кровеносный сосуд в качестве фокусной точки, медленно вводят флуоресцентный сывороточный альбумин Texas Red RAP или TRRSA, наблюдая за подъемом и падением флуоресценции из-за системного распределения, пока интенсивность в перитубулярной сосудистой и капиллярной петлях не будет чуть ниже насыщения. Через 10 минут приобретите 3D-объемы для всех отмеченных и изображенных клубочков с интервалом в 1 микрометр.

Найдите подходящий сосуд, капиллярную петлю или перитубулярный сосуд, затем поверните изображение, используя функцию Rotate, поскольку функция линейного сканирования в программном обеспечении для получения изображений требует, чтобы сосуд был перпендикулярным. После того, как сосуд повернут и лежит ровно, выберите функцию XT в меню «Приобретение» и настройте его на сканирование 4000 строк. Поместите линию поперек исследуемого сосуда с фокальной плоскостью на максимальный диаметр отрезка.

Затем щелкните левой кнопкой мыши на цветном составном изображении и выберите вкладку «Сделать снимок», чтобы создать эталонное изображение области, где было выполнено сканирование линии. Немедленно нажмите кнопку Пуск, чтобы захватить линейное сканирование судна. Позже импортируйте сканы линий в программное обеспечение для обработки изображений, чтобы определить скорость потока RBC.

В раскрывающемся меню Измерение откройте диалоговое окно Показать статистику региона и выберите инструмент «Рисование одной линии», чтобы нарисовать линию, соответствующую наклону теней RBC. Отметив ширину и высоту линии, используйте уравнение для расчета скорости, а затем получите в среднем пять вычислений, чтобы сообщить о скорости для каждого сканирования строки. Центрируйте клубочек в поле визуализации и принимайте набор 3D-данных, начиная с клубочковой поверхности и заканчивая 30-35 микрометрами.

Используйте шаг размером 1 микрометр в направлении Z. Идентифицируйте ЛЕЙК, сравнивая синий канал Хёхста с каналом техасского красного альбумина, ища исключение красного красителя в капиллярной петле и соответствующего ядерного пятна. Если WBC кажутся статичными на трех оптических секциях, определите ячейки как приклеенные, а затем сообщите значения как вхождение по 10 оптическим секциям от верхней части клубочка, взятым с интервалом в 1 микрометр.

Количество клубочков на поле у мюнхенских крыс Wistar Fromter или MWF было увеличено в 5-недельной группе UUO, чем у необработанных крыс. Крысы Sprague-Dawley, или крысы SD, перешли от отсутствия поверхностных клубочков к 2,02 на поле после пяти недель односторонней обструкции мочеточника. Наблюдались трехмерные реконструированные изображения для просмотра почечной поверхности.

5-недельная односторонняя обструкция урета у крыс SD не привела к областям, напоминающим нормальный канальцевый эпителий, как видно у MWF, необработанных и частично у 5-недельных крыс UUO MWF. При исследовании динамики почечных сосудов почечный кровоток был достоверно снижен в 5-недельных группах UUO MWF и SD по сравнению с необработанными крысами. Скорость RBC в клубочковых капиллярных петлях была значительно снижена у 5-недельных крыс UUO MWF и SD по сравнению с необработанными крысами MWF.

Кроме того, у необработанных крыс MWF было меньше ЛЕЙК на 10 оптических участков сверху, в то время как число увеличилось у 5-недельных UUO MWF и 5-недельных UUO SD крыс. При односторонней обструкции уретола наблюдалось увеличение проницаемости альбумина. Накопление альбумина в пространстве Боумена было интенсивным после односторонней обструкции уретола.

Эндоцитоз сегмента S1 в больших количествах альбумина наблюдается при физиологических условиях у необработанных КРЫС MWF. Такое же поглощение не наблюдалось у крыс MWF или SD после 5 недель односторонней обструкции уретала. Многие различные методы, такие как повторная визуализация для изучения процесса с течением времени, фиксация определенной области для визуализации и последующее использование фиксированной ткани для проведения микроскопии с более высоким разрешением, могут быть выполнены в сочетании с этим методом.

Техника считается разрушительной технологией. Это позволило следователям ответить на многие новые вопросы. При этом были предоставлены новые идеи и получены данные о смене парадигмы.