Количественная оценка активных форм кислорода с использованием 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда и проточной цитометрии в глиальных клетках Мюллера
13 мая 2022 г.
Здесь мы предлагаем систематизированный, доступный и воспроизводимый протокол для обнаружения клеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда (DCFH-DA) в глиальных клетках Мюллера (MMC). Этот метод количественно оценивает общие клеточные уровни АФК с помощью проточного цитометра. Этот протокол очень прост в использовании, подходит и воспроизводим.
Существует несколько методов измерения производства АФК или окислительного стресса в клетках. Среди них 2'7'дихлорфлуоресцеин диацетатный зонд является одним из наиболее широко используемых методов для непосредственного измерения окислительно-восстановительного состояния. Этот зонд является липофильным и нефлуоресцентным. Диффузия этого зонда через клеточную мембрану позволяет внутриклеточным эстеразам расщепляться на двух эфирных связях, производя относительно полярный и непроницаемый клеточной мембраной продукт. Эти нефлуоресцентные молекулы накапливаются внутриклеточным образом, и последующее окисление АФК дает высокофлуоресцентный продукт дихлорфлуоресцеин. Окисление зонда является продуктом действия нескольких типов АФК. Которые могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. В этой статье мы использовали дихлорфлуоресцеин диацетатный зонд для измерения и количественной оценки АФК с помощью проточной цитометрии. Переложите 6-луночные плиты в ламинарный проточный вытяжной из инкубатора. Аспирировать супернатанта. И вымойте клетки один раз с помощью PBS. Добавьте 2 мл низкого сывороточного DMEM на лунку. И инкубировать 6-луночную пластину в течение двух часов в инкубаторе. Обрабатывайте клетки антиоксидантом в течение шести часов. Обработайте клетки индуктором АФК, А или В, в течение 30 минут. Аспирировать супернатанта. И промыть клетку три раза PBS, чтобы удалить все раздражители. Выключите свет ламинарного вытяжки и работайте в темноте. Добавьте 1 мл дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда в DMEM без фенолового красного цвета. Добавьте 1 мл DMEM без фенольного красного цвета в контрольные ячейки управления автофлуоресценцией. Инкубируйте 6-луночную пластину в течение 30 минут в инкубаторе. Переложите пластины на льду в лабораторию. Промыть клетки три раза 2 мл холодного PBS на лунку. Добавьте 0,5 мл буфера холодного отсоединения в каждую скважину. Соберите клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью пипетки P1000. Соберите их в маркированную пробирку объемом 1,5 мл. И центрифугируйте их при 600 х г в течение пяти минут при 4 С. Осторожно выбросьте надосадочный материал и аккуратно отделите гранулу постукиванием. Добавьте 1 мл буфера FACS для промывки клеток к каждой маркированной трубке. При необходимости используйте вихрь наименьшей интенсивности для полной диссоциации гранулы. Центрифугируйте их при 600 х г в течение пяти минут при 4 С.Повторите этот шаг еще два раза. Всего три стирки. Повторное суспендирование клеточных гранул в 200 л буфера FACS. Аккуратно полностью диссоциировать гранулу в каждой трубке с помощью вихря. И переложить на маркированные 5 мл для проточных цитометрических трубок. Держите трубки на льду до анализа на проточном цитометре. Используя программное обеспечение для проточной цитометрии, создайте новый эксперимент. Нажмите на образец и откроется список трубок. Дважды щелкните и переименуйте их. Поместите трубку управления автофлуоресценцией на рычаг аспиратора, осторожно перемещая основание только влево. Щелкните Получить данные, а затем Записать данные и выберите нужное условие остановки. Нарисуйте ворота вокруг интересующих клеток, исключив мертвые клетки и мусор. Извлеките трубку. Нажмите кнопку Next Tube и запустите базовый контрольный образец. Щелкните Получить данные, а затем в поле Запись данных.Откройте программное обеспечение. Добавьте образцы с помощью кнопки действия Добавить образцы. Нажмите кнопку Добавить образец.Выберите папку Экспериментальная дата и нажмите кнопку Выбрать.Дважды щелкните первый образец в рабочей области, в данном случае элемент управления автофлуоресценцией. Нарисуйте полигональные ворота, чтобы изолировать интересующую ячейку, исключив мертвые клетки и мусор. Изменение графика на гистограмму. Двойной щелчок внутри M
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен протокол определения уровней клеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием зонда 2′,7′-дихлорфлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) в глиальных клетках Мюллера (MGCs). Данный метод разработан как доступный и воспроизводимый; количественная оценка АФК проводится с помощью проточной цитометрии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Окислительный стресс
- Нейробиология
Теоретические основы
- Активные формы кислорода (АФК) играют критическую роль в различных клеточных процессах.
- Измерение уровня АФК имеет важное значение для понимания окислительного стресса в клетках.
- Зонд DCFH-DA является широко используемым методом детекции АФК.
- Данный протокол делает акцент на воспроизводимости и простоте использования.
Цель исследования
- Предоставить четкий протокол для детектирования АФК в глиальных клетках Мюллера.
- Обеспечить возможность количественной оценки окислительного стресса в нейрональных клетках.
- Способствовать исследованию роли АФК в функциях глии и нейробиологии.
Используемые методы
- Для создания биологической модели был проведен культивирование глиальных клеток Мюллера.
- Для оценки уровней АФК клетки обрабатывали антиоксидантами и индукторами АФК.
- Для детекции АФК использовали зонд DCFH-DA с последующим количественным анализом методом проточной цитометрии.
- Критически важные этапы включали промывание клеток раствором PBS и контроль воздействия света во время проведения анализов.
Основные результаты
- Данный протокол позволил эффективно измерить уровни клеточных АФК в глиальных клетках Мюллера.
- Проточная цитометрия обеспечила количественный анализ накопления АФК.
- Результаты подтвердили возможность использования зонда DCFH-DA при заданных условиях.
Выводы
- Данное исследование устанавливает надежный метод оценки окислительного стресса в глиальных клетках.
- Протокол упрощает измерение АФК, повышая доступность метода для исследователей.
- Результаты имеют значение для понимания окислительного стресса в нейробиологии и поиска потенциальных терапевтических мишеней.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное измерение активных форм кислорода (АФК) в клетках мюллеровской глии с помощью DCFH-DA и проточной цитометрии позволяет провести надежную оценку механизмов окислительного стресса, актуальных для моделей нейродегенеративных заболеваний и заболеваний сетчатки. Эта возможность способствует валидации мишеней на ранних стадиях и снижению механистических рисков при модуляции путей антиоксидантного ответа. Достоверная количественная оценка АФК служит основой для принятия решений по портфелю молекул-кандидатов, нацеленных на окислительно-восстановительный гомеостаз в патологически значимых системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать активацию антиоксидантных путей и редокс-модуляцию в моделях глиальных клеток.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней, участвующих в окислительном стрессе и механизмах клеточной защиты.
- Обеспечивает механическое снижение рисков для потенциальных терапевтических средств, влияющих на уровни ROS.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает подготовку валидированных клеточных систем для скрининга соединений по показателям окислительного стресса.
- Позволяет получать стандартизированные количественные показатели АФК, подходящие для обеспечения воспроизводимости анализа и сравнения данных между исследованиями.
- Обеспечивает надежную оценку эффектов антиоксидантных или прооксидантных соединений в масштабируемом формате.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям заболеваний при патологиях сетчатки, связанных с окислительным стрессом, таким как диабетическая ретинопатия.
- Обеспечивает трансляционную преемственность, связывая модуляцию АФК in vitro со стратегиями поиска доклинических биомаркеров.
- Позволяет обоснованно оценивать риски при продвижении кандидатов в антиоксиданты на основе количественных клеточных показателей.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный рабочий процесс количественного определения АФК применяется на этапах от первичного поиска до идентификации соединений-лидеров, обеспечивая как проверку гипотез, так и интеграцию в последующий скрининг.
- Биология открытий: предоставляет количественные доказательства задействования окислительно-восстановительного пути и клеточного ответа на окислительные повреждения.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые измерения уровней АФК методом проточной цитометрии для сортировки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение уровней АФК в различных экспериментальных условиях с использованием среднего геометрического интенсивности флуоресценции.
- Трансляционные исследования: связывает модуляцию окислительного стресса in vitro с конечными точками, имеющими значение для заболевания в моделях сетчатки.
- Корпоративное использование: создает стандартизированную платформу анализа АФК, адаптируемую к различным типам клеток и агентам, модулирующим окислительно-восстановительные процессы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность при поиске мишеней, связанных с окислительно-восстановительными процессами, и снижает механистическую неопределенность.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированное, масштабируемое и воспроизводимое количественное определение АФК для рабочих процессов между различными группами.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки модуляторов путей антиоксидантной защиты и повышает эффективность использования капитала.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию кандидатов, нацеленных на механизмы окислительного стресса, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с проточными цитометрами и анализа данных.
- Необходим доступ к оборудованию для проточной цитометрии и совместимому программному обеспечению для анализа.
- Требуется междисциплинарная стандартизация протоколов гейтирования и количественного определения флуоресценции.
- Метод может быть адаптирован для других клеточных моделей при оптимизации протокола загрузки зондов и контролей.
- Результаты зависят от тщательной подготовки образцов для минимизации вариабельности анализа и артефактов, вызванных воздействием света.
