Выделение мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани крыс для дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки
29 августа 2022 г.
Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (Ad-MSC), могут быть потенциальным источником МСК, которые дифференцируются в инсулин-продуцирующие клетки (IPC). В этом протоколе мы предоставляем подробные шаги для выделения и характеристики ad-MSC придатка яичка крыс, за которым следует простой, короткий протокол для генерации IPC из тех же крыс Ad-MSC.
Общей целью этого протокола является выделение и характеристика красной жировой ткани, высушенных мезенхимальных стволовых клеток и дифференцировка их в сторону инсулин-продуцирующих клеток с помощью простых методов. Мезенхимальные стволовые клетки нашли свои пути в области генетики. Они могут быть выделены из различных источников, таких как костный мозг, жировая ткань и перинатальная ткань.
Они принимают отличные культурные характеристики. Они являются многомощными и потенциально могут лечить различные заболевания. Жировая ткань обеспечивает богатый источник мезенхимальных стволовых клеток.
Эти жировые МСК могут быть легко выделены из липоаспиратов с высоким выходом по сравнению с другими источниками, такими как костный мозг. И они могут обеспечить хороший источник как для аутологичной, так и для аллогенной трансплантации. В этом видео представлен простой протокол выделения и характеристики жировых мезенхимальных стволовых клеток из жира придатка яичка крысы.
Эта процедура является простым высокоэффективным методом изоляции. После изоляции мы перенесем дифференцировку этих жировых мезенхимальных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки с использованием простого, относительно короткого протокола. Начнем с выделения жировых мезенхимальных стволовых клеток путем коллагенового переваривания придатков яичка жира для получения более сильной сосудистой фракции.
Тогда мезенхимальные стволовые клетки будут характеризоваться их пластической адгезией, а также экспрессией CD-маркеров и дифференцировкой в несколько мезодермальных линий. Обезболивайте животное, затем усыпляете с помощью вывиха шейки матки. Распылите по всему телу 70% этанол и начните с иссечения кожи и мышц нижней части живота.
Затем обнажите яички с придатком яичка жира. Аккуратно срежьте придаточный жир. Будьте осторожны, чтобы не перерезать кровеносные сосуды с жирами.
В шкафу биологической безопасности разрежьте жировую ткань на мелкие кусочки с помощью щипцов и скальпеля. Переместите жировую ткань в центрифужную трубку, содержащую 10 миллилитров стерильного PBS. Начните стирку, наклонив трубку Falcon в течение 45 секунд.
Затем держите трубку в течение пяти минут, чтобы разделить ее на два слоя. Извлеките инфранированный PBS с помощью 10-миллилитрового шприца. Повторите эти шаги стирки четыре-пять раз, пока PBS не станет чистым.
После промывания повторно суспендировать жировую ткань в коллагеновом растворе, затем инкубировать на встряхивающей водяной бане до тех пор, пока ткань не станет почти однородной. После этого вихрьте тканевую коллагеновую смесь в течение 15 секунд, затем центрифугируйте в течение пяти минут. После центрифугирования у вас будет три слоя.
Осторожно отбросьте супернатант поверх стромальной сосудистой фракции. Сначала аккуратно отбросьте масляный слой сверху, затем слой эхо, не нарушая гранулу стромальной сосудистой фракции. Повторно суспендировать стромальную сосудистую фракцию в стерильном BSA и повторно центрифугировать в течение пяти минут.
Полную центрифугирование поместите полную среду DMEM F-12 в квадратную колбу площадью 25 сантиметров. После центрифугирования отбросьте супернатант и повторно суспендируйте стромальную сосудистую гранулу в полной среде DMEM F-12. И перенести на культурную колбу.
Поместите в 37 градусов 5% углекислого газа инкубатора. На следующий день удалите неприкрепленные ячейки и замените носитель свежим. Начиная со следующего дня изоляции, начнут появляться фибробластоподобные клетки.
Затем постепенно с течением времени они будут увеличиваться в количестве и размерах. При пассаже клетки станут более однородными. Эти клетки демонстрируют все критерии характеристики мезенхимальных стволовых клеток.
Эти клетки были дифференцированы в сторону инсулин-продуцирующих клеток с использованием этого простого протокола, содержащего никотинамид бета-меркаптоэтанол и эксендин-4. На протяжении этапов дифференцировки клетки начинают терять свою фибробластную форму, и я думаю, что кластерная морфология. При использовании инсулин-продуцирующих клеток наблюдается положительное окрашивание малиново-красного диситона, затем используемые инсулин-продуцирующие клетки экспрессируют различные бета-клеточные маркеры, такие как Pdx-1, mafA и инсулин.
Кроме того, индуцированные инсулин-продуцирующие клетки секретируют более высокие уровни инсулина в надосадочном веществе при вызове с более высокой концентрацией глюкозы. Мы предоставили подробный пошаговый протокол для выделения и характеристики жировых мезенхимальных стволовых клеток. Мы также приводим здесь относительно короткий, простой и эффективный протокол дифференцировки жировых мезенхимальных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки.
Это обеспечивает возможность для исследователя войти в область мезенхимальных стволовых клеток и изучить их дифференцировку в инсулин-продуцирующие клетки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе described процедура выделения и характеризации мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани (Ad-MSCs), из придаточных семенников крысы с их последующей дифференцировкой в инсулин-продуцирующие клетки (IPCs). Представленные методы просты в исполнении и разработаны для удобного применения в лабораторных условиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Регенеративная медицина
- Эндокринология
Теоретическая справка
- Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) могут быть получены из различных тканей, включая жировую ткань.
- Жировая ткань является богатым источником МСК с благоприятными характеристиками для культивирования.
- МСК обладают потенциалом к дифференцировке в различные типы клеток, включая инсулин-продуцирующие клетки.
- Понимание процесса дифференцировки может помочь в разработке методов терапии диабета.
Цель исследования
- Выделить и охарактеризовать МСК из придаточного семявезделя крысы.
- Разработать протокол дифференцировки этих клеток в IPC.
- Предложить надежный метод для будущих исследований в области регенеративной медицины.
Используемые методы
- Выделение МСК из жировой ткани придатоков семенников крысы.
- Характеристика выделенных МСК с использованием стандартных маркеров.
- Индукция дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки.
- Оценка функциональности ИПК после дифференцировки.
Основные результаты
- Успешная изоляция Ad-MSCs с характерными поверхностными маркерами.
- Продемонстрированная дифференцировка Ad-MSCs в IPCs.
- Функциональная оценка показала способность IPCs к секреции инсулина.
- Протокол представляет собой воспроизводимый метод получения IPCs из Ad-MSCs.
Выводы
- Ad-МСК являются подходящим источником для получения инсулин-продуцирующих клеток.
- Данный протокол может способствовать дальнейшим исследованиям в области лечения диабета.
- В будущих исследованиях может быть изучен терапевтический потенциал этих ИПК.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (Ad-MSCs), представляют собой возобновляемый и этически приемлемый источник для генерации инсулин-продуцирующих клеток (IPCs) в исследованиях диабета. Данный протокол описывает простой и воспроизводимый метод выделения и характеристики Ad-MSCs из эпидидимального жира крысы с последующей дифференцировкой в IPCs с использованием определенных биохимических сигналов. Этот подход способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов на ранних этапах разработки терапевтических средств для лечения метаболических заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать мультипотентность МСК и их дифференцировку в направлении бета-клеток поджелудочной железы.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированный источник МСК из жировой ткани с подтвержденной экспрессией CD90, CD73 и CD105 для воспроизводимости экспериментов.
- Научная ценность: позволяет провести функциональную валидацию IPC с помощью глюкозостимулированной секреции инсулина (GSIS) и окрашивания дитизоном для подтверждения функциональности, характерной для бета-клеток.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Получение индуцированных прогениторных клеток (IPC), экспрессирующих ключевые транскрипционные факторы бета-клеток (Pdx-1, MafA, NKX6.1, Ins1), для использования в анализах по скринингу соединений.
- Практическая ценность: Обеспечение масштабируемого производства IPC из МСК жировой ткани (Ad-MSCs) для высокопроизводительной оценки динамики секреции инсулина.
- Научная ценность: Содействие стандартизации анализа за счет использования последовательных протоколов дифференцировки с применением HG-DMEM, β-меркаптоэтанола, никотинамида и экзендина-4.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует трансляционную значимость путем получения IPC, которые реагируют на глюкозный вызов повышенной секрецией инсулина.
- Практическая ценность: обеспечивает преемственность доклинических исследований, предоставляя возобновляемый источник клеток для тестирования зависимости «доза-эффект» и эффективности на моделях диабета.
- Научная ценность: снижает биологические риски, подтверждая мультипотентность посредством остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировки перед индукцией IPC.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс разработки лекарственных средств, начиная с ранней валидации мишеней и заканчивая идентификацией соединений-лидеров и доклинической оценкой, что особенно актуально для терапии диабета, направленной на восстановление функции или замещение бета-клеток.
- Открывающая биология: поддерживает проверку гипотез о пластичности МСК и спецификации линий с использованием определенных сигналов дифференцировки.
- Скрининг: позволяет получать IPC, готовые к анализу, с количественно определяемыми показателями, такими как уровни секреции инсулина и экспрессия маркеров.
- Аналитика: предоставляет измеряемые конечные точки, включая GSIS, окрашивание дитизоном и qPCR на маркеры бета-клеток для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывают генерацию IPC in vitro с доклинической валидацией с помощью функциональных тестов на высвобождение инсулина.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для генерации IPC из жировых тканей в рамках нескольких проектов и клеточных линий.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в генерации IPC посредством характеристики нескольких линий и функциональной валидации.
- Практическая ценность: Стандартизация и воспроизводимость выделения и дифференцировки Ad-MSC в различных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Обоснование решений о целесообразности дальнейшей разработки ранних методов терапии диабета путем валидации клеточных моделей функции бета-клеток.
- Влияние на портфель разработок: Обеспечение приоритетности подходов на основе стволовых клеток для лечения метаболических заболеваний с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток, методами дифференцировки и проточной цитометрией для иммунофенотипирования.
- Необходим доступ к центрифугам, шкафам биологической безопасности, инкубаторам и оборудованию для проведения анализов глюкозозависимой секреции инсулина.
- Требуется стандартизация процедур переваривания, промывки и посева для обеспечения стабильного выхода стромально-васкулярной фракции.
- При применении метода к жировым депо разных локализаций или разным видам требуется адаптация сроков дифференцировки и концентраций реагентов.
- Ограничено необходимостью использования клеток 3-5 пассажа для обеспечения гомогенности и мультипотентности перед индукцией дифференцировки.
