Сравнение методов выделения энтомопатогенных грибов из образцов почвы
6 января 2022 г.
Энтомопатогенные грибковые колонии выделяют из образцов тропической почвы с помощью приманки Tenebrio , приманки Galleria , а также селективной искусственной среды, т. е. агара декстрозы картофеля, обогащенного дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом (среда CTC).
Выделение энтомопатогенных грибов имеет важное значение для разработки биопестицида и может быть полезно для изучения разнообразия, распространения и экологии этой конкретной группы. Использование приманок от насекомых для выделения энтомопатогенных грибов считается недорогим и высокоэффективным методом. хлорамфеникол, тиабендазол, циклогексимид, искусственные среды не используют додин и требуют меньше места в процессе отбора проб почвы.
Критические шаги включают исследование пластин CTC через одну и две недели, чтобы предотвратить сужение других грибов и развитие энтомопатогенных грибов, а затем идентификацию колоний энтомопатогенных грибов на основе их макроморфологии и микроморфологии. Начните со сбора 800 граммов грунта на глубину 10 сантиметров с помощью небольшой лопаты. Храните образцы в полипропиленовых мешках при комнатной температуре до начала эксперимента.
Небольшие корни также могут быть собраны, поскольку энтомопатогенные грибы, как известно, обладают ризосферной компетенцией. Для выделения грибов с использованием хлорамфеникола, тиабендазола, циклогексимида или селективной искусственной среды CTC взвесьте 0,35 г образца почвы с корнями или без них. Поместите этот образец в микропробирку размером 1,5 миллилитра.
Во время работы в шкафу биобезопасности добавьте один миллилитр стерильного 0,01 объемного процента полиоксиэтиленсорбитана моноолеатной водной суспензии в микротрубку, содержащую почву, и вихрь трубки в течение 30 секунд. Когда это будет сделано, снимите и пипетку 50 микролитров супернатанта на центр пластин Петри со средой CTC. Затем используйте стерильный дригальский шпатель диаметром шесть миллиметров для равномерного рассеивания суспензий по поверхности среды.
Инкубируйте плиты в климатических камерах при температуре 25 градусов цельсия и минимальной относительной влажности 80% в темноте. После семи, 14 и 21 дня инкубации наблюдайте за пластинами для роста колоний грибов. Для выделения грибов используют в качестве приманок для насекомых дезинфицируемые поверхностные Galleria mellonella и Tenebrio molitor поздней стадии личинок.
Погрузите личинку в 0,5% гипохлорит натрия на одну минуту для стерилизации. Затем дважды промыть личинок стерильной водой. Соберите приманки в пластиковые горшки с 10 небольшими отверстиями диаметром 10 миллиметров в крышке, содержащей 250 грамм собранного грунта.
Гомогенизируйте почву через день, чтобы обеспечить максимальный контакт личинок с почвой и ежедневно анализируйте горшки, ища мертвых насекомых. После удаления мертвых насекомых из горшка поверхностно стерилизуйте насекомых 0,5% гипохлорита натрия в течение одной минуты. Чтобы облегчить микоз, поместите стерильных насекомых во влажную камеру при относительной влажности 80% и 25 градусах Цельсия на семь дней.
При микозе собирают конидии с поверхности насекомого и с помощью микробиологической петли помещают конидии на среду агара декстрозы картофеля, содержащую 0,05% хлорамфеникола или среду PDAC под стереоскопическим микроскопом. В качестве альтернативы поместите целых инфицированных личинок в среду PDAC. И инкубируйте культурные пластины в климатической камере, как объяснялось ранее.
После 14 дней инкубации определите виды EPF, проанализировав макроморфологические характеристики грибковых культур на пластинах, как описано в рукописи. Далее перекладывают воздушные конидии на скользящие культуры в течение трех суток при относительной влажности 80% и температуре 25 градусов Цельсия. Через три дня окрашивают горку лактофенолом в синий цвет, чтобы наблюдать микроскопические особенности.
Под оптическим микроскопом наблюдайте грибковые структуры, такие как расположение, конидиофоры, форма и размер конидий в 400 раз и подтвердите идентификацию EPF. В ходе исследования 51 штамм EPF видов Metarhizium и Beaveria был выделен из 524 образцов почвы. Репрезентативный анализ показывает микроморфологические характеристики нескольких изолятов видов Metarhizium и Beaveria.
Встречаемость EPF в 24 образцах почвы была изучена с использованием трех различных методов изоляции. Приманка Galleria mellonella оказалась более эффективной в изоляции, за ней следуют приманка Tenebrio molitor и среда CTC. Те же 24 образца почвы не показали восстановления видов Beaveria, а только Metarhizium.
Наиболее важными вещами, которые следует помнить, являются перенос воздушных конидий на скользящее покрытие, наблюдение за особенностями микроскопа и подтверждение идентификации энтомопатогенных грибов с помощью морфологических ключей. Дополнительные методы включают использование других селективных искусственных сред со специфическими химическими веществами для уменьшения роста загрязняющих веществ, таких как додин. Поиск новых грибковых изолятов с выдающимися чертами биоконтроля имеет решающее значение для повышения эффективности грибов в борьбе с членистоногими и вредителями и изучения дальнейших вопросов в области патологии беспозвоночных.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается выделение энтомопатогенных грибов из тропических почв с использованием насекомых-приманок, при этом особое внимание уделяется эффективности различных методов. Целью выделения является углубление понимания грибного разнообразия и содействие разработке биопестицидов.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Энтомопатогенные грибы
- Микробиология почвы
- Разработка биопестицидов
Теоретические сведения
- Недорогие методы выделения энтомопатогенных грибов.
- Значимость анализа почвенных образцов для экологических исследований.
- Использование селективных сред для эффективного выделения грибов.
Используемые методы
- Выделение грибов с использованием насекомых-приманок (Galleria mellonella и Tenebrio molitor).
- Использование селективных искусственных сред (среда CTC, картофельно-декстрозный агар).
- Микроскопическое исследование для идентификации видов грибов.
Основные результаты
- 51 штамм видов Metarhizium и Beauveria, выделенных из 524 образцов почвы.
- Приманка в виде Galleria mellonella продемонстрировала самую высокую эффективность для выделения грибов.
- Виды Beauveria в протестированных образцах не обнаружены.
Выводы
- В исследовании эффективно продемонстрированы методы выделения энтомопатогенных грибов.
- Полученные результаты вносят вклад в исследования по биоконтролю и имеют потенциал для применения в сельском хозяйстве.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Выделение энтомопатогенных грибов из почвы является основополагающим этапом в поиске биопестицидов, где эффективность метода напрямую влияет на валидацию мишеней и идентификацию перспективных кандидатов. Сравнение использования насекомых-приманок и селективных сред позволяет снизить риски при скрининге потенциальных противогрибковых препаратов на ранних этапах за счет повышения выхода изолированного материала и сокращения числа ложноотрицательных результатов. Это способствует повышению прогностической достоверности при выборе мишеней для программ борьбы с вредителями из класса членистоногих.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать биоразнообразие грибов в почвенных экосистемах для выявления новых штаммов Metarhizium и Beauveria с потенциальной биологической активностью.
- Практическая ценность: методы использования насекомых в качестве приманки (Galleria mellonella, Tenebrio molitor) обеспечивают более высокую эффективность изоляции, чем среда CTC, расширяя доступ к целевым организмам для последующей характеристики.
- Прикладная ценность: изолированные штаммы способствуют снижению рисков при изучении механизмов, связывая фенотипическую вирулентность с генетической идентичностью посредством морфологической и молекулярной идентификации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Предоставляет валидированные изоляты грибов для разработки анализа, направленного на изучение патогенности для членистоногих и специфичности круга хозяев.
- Практическая ценность: Стандартизированные протоколы выделения с использованием насекомых-приманок повышают воспроизводимость и масштабируемость процесса выделения грибов из различных партий почвенных проб.
- Готовность к анализу: Позволяет подготавливать чистые культуры для сбора конидий и морфологического подтверждения с помощью микроскопии, что обеспечивает единообразие исходных данных при фенотипическом скрининге.
Трансляционные и доклинические исследования
- Система, релевантная заболеванию: Изолированные штаммы EPF служат доклиническими моделями для оценки вирулентности в отношении насекомых-вредителей, что соответствует разработке препаратов для биологического контроля.
- Прогностическая достоверность: Молекулярная идентификация изолятов на видовом уровне повышает уверенность в выборе мишени и обосновывает отбор штаммов для исследований по созданию лекарственных форм.
- Непрерывность: Установленные рабочие процессы выделения позволяют осуществлять лонгитюдный мониторинг присутствия грибов в сельскохозяйственных почвах, что дает информацию для стратегий управления резистентностью и ротации штаммов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод изоляции вписывается в рабочие процессы раннего этапа поиска, при которых выделенные штаммы EPF проходят фенотипический скрининг на вирулентность и специфичность к хозяину, что позволяет определить перспективные варианты для разработки биопестицидов.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез об экологии и патогенности грибов, обеспечивая выделение энтомопатогенных грибов (ЭПГ) из сложных почвенных матриц.
- Скрининг: позволяет получать стандартизированные препараты грибов для высокопроизводительных анализов вирулентности с использованием насекомых в качестве хозяев.
- Аналитика: результаты морфологической и молекулярной идентификации предоставляют количественные и качественные данные для сравнения и отбора штаммов.
- Трансляционные исследования: связывают изоляцию из окружающей среды с доклинической оценкой за счет консервативных механизмов вирулентности Metarhizium и Beauveria.
- Корпоративное повторное использование: протокол изоляции с использованием приманок из насекомых может быть стандартизирован для различных площадок и типов почв, что позволяет создавать масштабируемые банки штаммов грибов для будущих кампаний по скринингу.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: расширяет разнообразие целевых объектов и снижает механистическую неопределенность при выборе мишеней EPF для разработки биопестицидов.
- Практическая ценность: методы использования приманок для насекомых обеспечивают более высокий выход и меньшую техническую вариабельность по сравнению с селективными средами, что повышает вероятность успешной изоляции.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о целесообразности дальнейшей работы при приоритизации штаммов за счет расширения доступа к вирулентным изолятам из образцов окружающей среды.
- Влияние на портфель разработок: способствует продвижению проектов с учетом рисков путем расширения пула охарактеризованных штаммов EPF с подтвержденной морфологией и идентичностью.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с насекомыми, знания в области морфологии грибов и владение методами асептики для приготовления приманок и сбора конидий.
- Необходимы инкубационные камеры с регулируемым климатом, поддерживающие температуру 25°C и влажность 80% для роста грибов и индуцирования микоза.
- Для обеспечения стандартизации между исследовательскими группами требуется единообразие в стерилизации приманок, гомогенизации почвы и сроках обработки после развития микоза.
- Адаптация к различным типам почв может потребовать корректировки времени экспозиции приманок и объема почвы в зависимости от распространенности местных EPF.
- Ограничения включают зависимость от жизнеспособности личинок и условий окружающей среды, влияющих на успех развития микоза, что обусловлено использованием влажных камер и этапами поверхностной стерилизации, описанными в протоколе.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:07
Soil Sampling and Isolation Methods for Entomopathogenic Fungi (EPF)
4:29
Identification of Entomopathogenic Fungi (EPF): Metarhizium and Beauveria Species
5:21
Results: Micromorphological Characteristics and Occurrence of Entomopathogenic Fungi in Various Soil Samples
6:16
Conclusion
