Протокол для моделирования бластоидов человека Разработка и имплантация бластоцисты

Исследования человеческих эмбрионов ограничены их низкой доступностью и этическими проблемами, поэтому получение индивидуальных моделей, которые точно воспроизводят раннее развитие человека, будет поддерживать научный и медицинский прогресс. Способность этого метода предсказывать развитие человека зависит от его способности эффективно воспроизводить последовательности клеточного определения и морфогенеза бластоцисты в соответствии с последовательностью развития и темпом, и такое моделирование обеспечит образование клеток, которые действительно отражают стадию бластоцисты. В будущем человеческие бластоиды могут быть использованы для идентификации терапевтических мишеней и способствовать доклиническому моделированию, например, для улучшения среды экстракорпорального оплодотворения или для разработки негормональных контрацептивов.

Демонстрировать процедуру будут Харунобу Кагава, Алок Джавали, Хейдар Хейдари Хоэй, Тереза Мария Зоммер и Джованни Сестини. Для начала подготовьте и предварительно прогрейте носитель PXGL, базальную среду N2B27, моющий буфер, PBS и агрегационную среду. Исключить MEF из суспензии hPSC для образования бластоидов.

Для исключения MEF приготовьте пластину с желатиновым покрытием, добавив один миллилитр 0,1% желатина в лунку шестилуночной пластины. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-90 минут. Чтобы собрать клетки, удалите среду и промыть клетки одним миллиметром PBS.

Добавьте 500 микролитров раствора для отсоединения клеток в каждую лунку из шести лунок и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы проследить диссоциацию колоний на отдельные клетки. Раствор для отсоединения клеток разбавляют одним миллилитром промывочного буфера.

Соберите клетки с пластины, аккуратно пипетировав от пяти до 10 раз. Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую трубку. Раскрутите ячейки при 200 RCF в течение четырех минут.

Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в 1,5 миллилитрах среды PXGL в каждой лунке. Посейте клетки на пластины с желатиновым покрытием для исключения MEF и инкубируйте пластины при 37 градусах Цельсия в течение 60-90 минут. Как только наивные клетки будут засеяны для исключения MEF, удалите PBS из MicroWells и уравновесьте лунки 200 микролитрами базальной среды N2B27 для каждого чипа MicroWell и инкубируйте в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия.

Соберите супернатант, содержащий неприкрепленные наивные клетки. Переложите его в 15-миллилитровую трубку и раскрутите клетки при 200 RCF в течение четырех минут. Отбросьте среду и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре базальной среды N2B27.

Подсчитывайте ячейки с помощью слайдов подсчета ячеек. Раскрутите ячейки при 200 RCF в течение четырех минут. Отбросьте среду и добавьте соответствующее количество среды N2B27, содержащей 10 микромоляров Y27632, чтобы получить плотность клеток 30 000 клеток на 50 микролитров.

Удалите среду из уравновешенных массивов MicroWell и добавьте 25 микролитров среды N2B27 с 10 микромоляриями Y27632. Добавьте 50 микролитров клеточной суспензии и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут, чтобы клетки упали в нижнюю часть MicroWell. Затем добавляют 125 микролитров среды N2B27, дополненной 10 микромолярами Y27632.

В течение 24 часов на чипе MicroWell будут наблюдаться агрегаты наивных GPS-систем. Инициируют образование бластоидов путем подготовки среды PALY. Предварительно разогрейте его при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут.

Удалите агрегационную среду и добавьте 200 микролитров предварительно расплавленной среды PALY в MicroWells. Поместите пластину для культивирования клеток обратно в гипоксический инкубатор при температуре 37 градусов цельсия. Повторите изменение мультимедиа в первый день.

На второй день удалите среду PALY и добавьте 200 микролитров среды N2B27, дополненной LPA и 10 микромолярами Y27632. Повторите смену носителя на третий день. Полное образование бластоидов происходит к четвертому дню.

Приготовьте наивную клеточную суспензию hPSC для образования бластоидов, как описано ранее. Отбросьте среду и добавьте соответствующее количество среды N2B27, содержащей 10 микромоляров Y27632, чтобы получить плотность клеток 70 клеток на 100 микролитров среды. Чтобы сгруппировать ячейки на дне скважин, центрифугируйте пластину при 200 RCF в течение двух минут при комнатной температуре.

Инкубируют пластину при температуре 37 градусов Цельсия в гипоксических условиях культивирования. В течение 24 часов на скважинах будут наблюдаться агрегаты наивных ГПСК. Добавьте в колодцы 100 микролитров свежеприготовленной и предварительно приготовленной среды в два раза.

Поместите пластину для культивирования клеток обратно в гипоксический инкубатор при температуре 37 градусов цельсия. Через 24 часа выбросьте половину носителя и замените его 100 микролитрами предварительно расплавленной среды PALY. Повторяйте этот шаг до четвертого дня.

Подготовьте наивную клеточную суспензию HPSC для формирования тропосферы, как описано ранее. Как только агрегаты наивных ГПСК образуются через 24 часа, обменивайте среду агрегации с PALY без LIF, дополненную тремя микромоляльными SC144, чтобы сформировать трофосферы, представляющие раннюю трофэктодерму. Для образования трофосферов, представляющих собой зрелую трофэктодерму, обменивают среду агрегации на PALY, дополненную двумя микромоляльными XMUMP1.

Обновляйте среду ежедневно. Полное формирование трофосферы происходит к четвертому дню. Чтобы оценить состояния клеток, сравните транскриптомные данные бластоидов и трофосферов с соответствующими контрольными элементами, включая постимплантационные стволовые клетки трофобласта человека.

Наивные hPSCs, культивируемые в PXGL, представляли собой агрегированные и кавитированные структуры, которые возникали между 48 и 72 часами после индукции PALY и достигали диаметра от 150 до 250 микрометров в течение 96 часов. Основываясь на морфометрических параметрах и наличии трех линий, эффективность индукции достигала от 70 до 80%, трофосферы образовывались с эффективностью от 50 до 60% в течение 96 часов после индукции. Бластоидное образование было успешным в коммерчески доступных сверхнизких прикрепленных 96-луночных пластинах в оптимизированных условиях индукции.

Технология секвенирования одноклеточной РНК была использована для дальнейшей характеристики состояния бластоидных клеток. Ячейки отображают заметно воспроизводимо различные кластерные профили, независимо от параметров, используемых для выполнения кластеризации и визуализации данных, что позволило уверенно различать три линии бластоцисты. Между 24 и 60 часами плюрипотентные стволовые клетки PXGL образуют аналоги эпибласта и трофэктодермы.

Затем между 60 и 96 часами образуются аналоги полярной трофэктодермы и примитивной энтодермы. Это последовательность спецификации внутри бластоцисты, таким образом, бластоиды повторяют последовательность развития спецификации линии. Слияние наборов данных бластоидов со ссылочным набором данных клеток, выделенных из эмбрионов на разных стадиях развития, показало, что 97% клеток бластоидов сгруппированы с клетками бластоцисты, но не с клетками из постимплантационных эмбрионов.

Независимый анализ подтвердил, что со временем стволовые клетки сформировали клетки, которые транскрипционно соответствовали клеткам человеческих эмбрионов между пятым и 7,5-м днем. Это действительно стадия развития, во время которой формируется бластоциста человека. Они также подтвердили, что более 95% клеток в бластоидах имеют транскриптом, который соответствует трем клеточным линиям бластоцист, в то время как 3% клеток были вне цели и соответствовали стадиям после имплантации.

Следует отметить, что мы заметили, что наши первоначальные 2D-культуры также составляют около 5% клеток-мишеней. Эквивалентную стадию развития также можно визуализировать, глядя на паттерны экспрессии конкретных маркеров, таких как CDX2 для трофэктодермы бластоцисты и PRMD14 для эпибласта бластоцисты. Качество исходной культуры PXGL абсолютно важно, и количество клеток в исходном агрегате также имеет решающее значение, и его можно контролировать с помощью MicroWells.

Общий размер клеточного агрегата через 24 часа должен составлять от 50 до 70 микрометров. Эффективное формирование фазовых фулластоидов прокладывает путь для изучения процессов имплантации и постимплантационного развития эмбриона человека.