Эффективная sars-CoV-2 количественная обратная транскриптаза ПЦР стратегия диагностики слюны с использованием роботов для пипетирования с открытым исходным кодом

Мы разработали недорогой диагностический тест на COVID-19 на основе слюны, который легко внедрить и масштабировать для крупномасштабных приложений скрининга сообщества. Здесь мы используем роботов с открытым исходным кодом для обработки жидкостей, стандартные термоциклеры и программное обеспечение для выполнения прямого тестирования слюны без буферов экстракции или стабилизации, обеспечивая при этом точные диагностические результаты. Благодаря простым автоматизированным параллельным рабочим процессам система может быть масштабирована для выполнения тысяч тестов в день с минимальными требованиями к оборудованию, пространству и персоналу.

В дополнение к Кайли Кинг, Рэйчел Хэм, наш руководитель клинической лаборатории и Остин Смотерс, наш координатор по образованию, помогут продемонстрировать процедуру Начните с дезактивации наружной части пробирок для сбора слюны с 70% этанолом и передачи их в лабораторию для тестирования. Запишите прибытие образца, отсканировав каждый образец штрих-кода в электронную таблицу ежедневного приема. Термически обработайте сканирующие образцы в течение 30 минут в печи с температурой 95 градусов Цельсия, а затем извлеките образцы с помощью термостойких перчаток.

Откройте электронные таблицы ежедневной загрузки образцов для каждого робота-загрузчика образцов на станции назначения образцов. Затем назначают 188 образцов на каждую плиту из 384 скважин. Лотки для этикеток с названием пластины, датой и номером квартала.

Отсканируйте образцы по порядку в электронную таблицу загрузки образцов. На станции загрузки образцов выстройте два полных комплекта из восьми 3D-печатных стеллажей, соответствующих размещению палубы в роботе. Снимите крышку с четверти одной трубки и поместите их в стойки для 3D-печати, начиная с позиции A1 в стойке.

Заполняйте каждую стойку слева направо и сверху вниз. Продолжайте эту схему загрузки во второй стойке, затем переходите к стойкам четыре и пять. Разместите загруженные четверть одной пробы стеллажей на палубах один, два, четыре, пять, семь, восемь, 10, 11.

Разместите наконечники P20 на палубах три и девять. Чтобы упростить процесс настройки, загрузите материалы сзади наперед в робота. Пластины мастер-микса производятся на специальном роботе и хранятся при четырех градусах Цельсия.

Одна пластина используется за один раз и маркируется именем пластины, а острое лезвие используется для резки линии в фольге вокруг контрольных скважин. Поместите основную табличку смеси на шестую палубу и снимите крышку из фольги, оставив после себя небольшой прямоугольник, покрывающий контрольные колодцы. Откройте коробки с наконечниками и закройте робота.

Инициализируйте пользовательский операционный протокол Python, нажав кнопку Начать запуск через настольное приложение робота. Каждый квартал занимает 24,5 минуты для загрузки на тарелку. Установите таймер в качестве напоминания.

Пока робот работает, открутите и загрузите четверть двух пробирок для образцов во второй комплект 3D-печатных стоек. Когда робот сделает паузу, снимите четверть одной стойки и замените их четвертью двумя стойками, затем нажмите возобновить запуск в настольном приложении. Подведите итоги четверти одной пробы и храните их в холодильнике с температурой четыре градуса Цельсия в ожидании результатов.

Повторите этот процесс загрузки в течение третьего и четвертого кварталов. Перенесите загруженную пластину в шкаф биобезопасности. Чтобы свести к минимуму загрязнение, держите пластину закрытой во время переноса.

Соберите любые повторные образцы и назначьте их в качестве последних образцов в четвертом квартале. Пронумеруйте образцы, отсканируйте штрих-коды и введите исходное местоположение образца и результат в электронную таблицу загрузки образца. Перенесите повторные образцы в шкаф биобезопасности.

Не загружайте повторные пробоотборники в загрузочные стойки робота. Пипетка по два микролитра каждого повторного образца в нужные скважины. Используйте специальную пипетку для добавления образцов пациента.

Держите контрольные колодцы покрытыми фольгой, добавляя образцы, чтобы свести к минимуму загрязнение. Снимите крышку из фольги над контрольными колодцами с помощью щипцов. Пипетка двух микролитров подтвержденных положительных образцов пациентов в скважины М23 и М24.

Пипетка двух микролитров воды без нуклеазы в скважины от N23 до N24 и два микролитра по 200 копий на микролитр смешанного положительного контроля к скважинам O23 до O24. Оставьте скважины от P23 до P24 пустыми, чтобы контролировать качество основной партии смеси. Накройте пластину оптически прозрачным уплотнением и используйте аппликаторный ролик, чтобы прикрепить уплотнение ко всем скважинам.

Вихрьте пластину при 2 500 об/мин в течение 30 секунд, чтобы тщательно перемешать, затем центрифугируйте пластину в 500 раз G в течение одной минуты. Выберите программу протокола в программном обеспечении термоциклера и сохраните протокол для будущих пластин. Поместите герметичную пластину в термоциклер и запустите протокол.

Экспортируйте значения CT и скопируйте их в таблицу загрузки образца. Для положительного контроля проверьте, дает ли по крайней мере одна положительная контрольная скважина значения КТ от 22 до 28 для зондов P1 и N1. Альтернативно, известные положительные пробовые скважины дают значения P1 и N1 CT менее 33 на зондах P1 и N1.

Для отрицательного контроля убедитесь, что ни в одной из двух отрицательных контрольных скважин нет значений КТ N1 или P1. Убедитесь, что значения КТ имеют допустимые кривые усиления, прежде чем аннулировать пластину. Если P1 дает результат КТ менее 33, считайте скважину действительной и переходите к результату из N1. Если P1 дает результат КТ больше или равен 33 или не имеет значения КТ, считайте скважину недопустимой.

Если N1 дает результат КТ менее 33, оцените скважину как да. Если N1 не дает значения КТ, оцените скважину как нет. Если N1 дает значение КТ больше или равно 33, оцените колодец как нет звезды.

Убедитесь, что все значения N1 CT связаны с реальной кривой усиления. Если значение КТ для N1 не имеет кривой усиления, то скважина — нет. Определите повторяющиеся образцы, пометьте их внутренним номером образца и типом образца и верните их в рабочий процесс загрузки.

Репрезентативные изображения показывают обнаружение RTQ PCR синтетической РНК N1 или SARS CoV-2 и синтетической ДНК P1 или HSRPP30. Стандартные кривые были построены со стандартными отклонениями для определения диапазона точного обнаружения с использованием этой комбинации грунтовки зонда. Средние значения КТ, полученные в соответствующих разведениях, были построены по отношению к расчетному количеству синтетической РНК и синтетической ДНК.

В обоих случаях линейные кривые показали хорошие коэффициенты корреляции в широком диапазоне концентраций копий генов. Значения N1 CT, полученные из уникальных образцов с использованием как робота, так и ручной загрузки образца, были перенесены для определения межпробирной изменчивости между ручной и роботизированной загрузкой. Линейная зависимость между ручным и автоматизированным методами дала высокий коэффициент корреляции, указывающий на то, что оба метода функционально эквивалентны.

Вариабельность внутри анализа также определяли с использованием транспонированных реплицированных значений КТ N1, полученных как от робота, так и от ручной загрузки образца. Здесь показана оценка методов термообработки для снижения вязкости слюны. Отрицательная слюна SARS CoV-2 собиралась из одного источника, а аликвоты подвергались термической обработке в течение нулевых минут, 30 минут или 60 минут при 95 градусах Цельсия.

Значения P1 CT из технических реплик каждого состояния были построены для определения изменчивости между методами лечения. Как 30-минутный, так и 60-минутный методы термической обработки приводили к значительному снижению изменчивости образца по сравнению с отсутствием контроля обработки. Не было существенной разницы между 30-минутными и 60-минутными процедурами.

Поэтому для сокращения времени обработки был реализован 30-минутный метод термообработки. Используйте надлежащую асептическую технику для минимизации загрязнения испытательных пластин, особенно при загрузке ручных образцов и элементов управления. Избегайте пересечения тарелки руками или рукавами.

После получения клинических результатов образцы могут быть утилизированы в отходах биологической опасности или сохранены для дальнейшего анализа, такого как секвенирование всего генома для определения конкретных штаммов. Этот метод позволяет проводить широкомасштабное тестирование сообщества, что позволяет нам исследовать последствия охвата тестированием и несимптоматическое распространение Covid-19.