Удаление внутреннего трансляционного стартового участка из мРНК при сохранении экспрессии полноразмерного белка
16 марта 2022 г.
Настоящий протокол описывает одну мутацию M213L в Gja1, которая сохраняет полноразмерную генерацию Connexin43, но предотвращает трансляцию меньшей изоформы GJA1-20k с внутренней трансляцией.
Трудность с заменой одного остатка заключается в эффективном генотипировании животных, несмотря на разницу в единичном остатке. Специальное использование фермента рестрикции добавляет только один, быстрый и недорогой шаг к типичному генотипированию на основе ПЦР. Этот протокол может быть применен к любой другой мышиной модели с точкой мутации, если целевая последовательность распознается ферментом рестрикции, что обычно и происходит.
Отрежьте один-три миллиметра кончика хвоста чистыми ножницами и переложите его в 0,2-миллилитровую восьмиполосную ПЦР-трубку. После хранения образца хвоста, как описано в рукописи, храните его при Т-минус 20 градусах Цельсия до извлечения, примерно до недели. Добавьте 100 микролитров раствора лизиса тканей на пробирку и хорошо перемешайте, а затем открутите вниз с помощью настольной миницентрифуги при 2, 200 раз G в течение 10 секунд при комнатной температуре.
Убедитесь, что образцы хвоста погружены в раствор. Установите трубки на термоциклер, запрограммировав параметры лизиса, инактивации и удержания тканей. Храните тканевый лизат при четырех градусах Цельсия в течение недели, если ПЦР не может быть выполнена немедленно.
Готовят раствор ПЦР, содержащий пять микролитров воды без нуклеазы, 0,75 микролитра 10-микромолярной прямой и обратной праймеров и 7,5 микролитра мастер-смеси ПЦР на образец в новую ПЦР-трубку. Добавьте один микролитр предварительно приготовленного тканевого лизата в раствор ПЦР. Хорошо перемешайте раствор ПЦР и открутите его с помощью настольной миницентрифуги при 2, 200 раз g в течение 10 секунд при комнатной температуре.
Установите трубки на программируемый тепловой цикл. Как только реакция будет завершена, храните продукты ПЦР при четырех градусах Цельсия в течение одного-двух месяцев или примерно одного года при минус 20 градусах Цельсия. Приготовьте раствор фермента, содержащий семь микролитров воды без нуклеазы, два микролитра буфера CutSmart с силой 10X и один микролитр фермента рестрикции NlaIII.
Если образцов несколько, умножьте каждое содержимое, чтобы получилась смесь, и аликвотьте 10 микролитров на пробирку. Добавьте 10 микролитров ранее полученного продукта ПЦР к раствору фермента на пробирку. Хорошо перемешайте и раскрутите с помощью настольной мини-центрифуги, как показано ранее.
Установите трубки на программируемый тепловой циклер или тепловой блок. Хранить продукт после инкубации в холодных условиях. Добавьте 0,75 г агарозы в 50 миллилитра однопрочного буфера TAE.
Смешайте и нагрейте агарозу в микроволновой печи, пока она полностью не растворится. После охлаждения добавьте пять микролитров пятна ДНК и аккуратно перемешайте. Налейте 25 миллилитров агарозного геля в гелевую форму и дайте гелю затвердеть.
Загрузите в скважину 10 микролитров переваренного продукта ПЦР. Запустите гель со 100 вольт в течение 35 минут. Изобразите агарозный гель под ультрафиолетовым светом.
Электрофорез агарозы, выполненный с использованием переваренного продукта ПЦР, привел к образованию нескольких полос разных размеров в каждом генотипе, с двумя полосами в диком типе, тремя в гетерозиготных и одной в гомозиготных, соответственно. Тестовая инъекция с анализом бластоцисты привела к 76,9% успеха при введении 50 нанограммов на микролитр донорского олиго и 25% успеха при введении 25 нанограммов на микролитр того же донорского олигоса, соответственно. Наконец, инъекция 50 нанограммов на микролитр донорских олиго с осаждением этанола получила животных-основателей с 50%-ным успехом.
Очистка доноров олиго осаждением этанола снижала токсичность при сохранении высокой эффективности редактирования генома. Тщательное обращение и при добавлении небольшого количества реагентов очень важно. Убедитесь, что они правильно добавлены и хорошо перемешаны.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод генотипирования животных с единичной мутацией M213L в гене Gja1, которая приводит к продукции полноразмерного белка Connexin43, предотвращая при этом трансляцию более короткой изоформы GJA1-20k. В методе подчеркивается эффективность и экономическая целесообразность использования рестриктаз в сочетании с генотипированием на основе ПЦР.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Генетика
- Молекулярная биология
- Животные модели
Теоретические основы
- Важность идентификации генетических мутаций
- Сложности при замене одного остатка
- Применение рестриктаз в генотипировании
Используемые методы
- Генотипирование на основе ПЦР
- Мышиные модели с точечными мутациями
- Электрофорез ДНК в агарозном геле
Основные результаты
- Успешная идентификация генотипов с различными паттернами полос
- Высокая эффективность получения животных-основателей
- Подтвержденная эффективность описанных методов генетического анализа
Выводы
- В исследовании представлен эффективный протокол генотипирования мутаций в моделях мышей.
- Работа предлагает ценные методологии для генетических исследований в области биологии развития.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет проводить точное генотипирование точечных мутаций в моделях мышей, что необходимо для исследований по валидации мишеней, в которых требуется детальный анализ изоформ-специфической экспрессии белков. За счет устранения мешающих усеченных изоформ при сохранении функции полноразмерного белка этот метод позволяет снизить риски при изучении механизмов на ранних этапах поиска. Данный подход повышает прогностическую достоверность терапевтических гипотез, касающихся биологии Connexin 43 и связанных с ней путей щелевых контактов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем выделения функционального вклада полноразмерного белка Cx43 в сравнении с изоформами с усеченным N-концом.
- Практическая ценность: обеспечивает масштабируемый метод генотипирования для различения аллелей дикого типа, гетерозиготных и гомозиготных мутантных аллелей в больших когортах.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля исследований, уточняя, связаны ли наблюдаемые фенотипы с потерей полноразмерного белка или с механизмами, специфичными для конкретных изоформ.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: получение образцов ДНК с паттернами рестрикционных фрагментов, подходящих для рабочих процессов высокопроизводительного скрининга.
- Количественный выход: обеспечение аллель-специфического количественного определения с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов после ПЦР.
- Воспроизводимость: стандартизация генотипирования в различных лабораториях за счет недорогого добавления одного фермента в существующие протоколы ПЦР.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Облегчает создание доклинических моделей, в которых транспорт Cx43 и сборка щелевых контактов играют роль в развитии сердечных, нейронных или онкологических заболеваний.
- Трансляционная преемственность: Связывает молекулярный генотип с фенотипическим результатом путем сохранения экспрессии полноразмерного Cx43 при одновременном снижении уровня GJA1-20k.
- Принятие решений с учетом рисков: Помогает определить критерии принятия решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), позволяя сопоставить уровни экспрессии изоформ с функциональными показателями in vivo.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишени до доклинических испытаний эффективности, особенно в тех случаях, когда необходимо разграничить функции специфических изоформ белков.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез, позволяя создавать генетические модели для разграничения функций полноразмерного белка и активности усеченных изоформ.
- Скрининг: Обеспечивает получение готовой к анализу геномной ДНК для последующего применения, такого как валидация CRISPR или управление племенными колониями.
- Аналитика: Обеспечивает четкие, поддающиеся количественной оценке паттерны полос на агарозном геле, что позволяет быстро определить генотип без проведения секвенирования.
- Трансляционные исследования: Позволяет проводить доклинические исследования, в которых локализация Cx43 в мембране и межклеточная коммуникация являются ключевыми механистическими конечными точками.
- Корпоративное повторное использование: Адаптируема к любой точечной мутации, при которой можно ввести или разрушить сайт рестрикции, что представляет собой универсальную платформу для генотипирования.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней за счет изоляции вклада конкретных изоформ.
- Операционная ценность: Повышает пропускную способность и снижает стоимость анализа одного образца благодаря единственному этапу рестрикционного переваривания после ПЦР.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность при принятии решений по оптимизации ведущих соединений за счет уточнения взаимосвязей между генотипом и фенотипом.
- Влияние на портфель: Обеспечивает продвижение кандидатов, нацеленных на Cx43-зависимые пути, с учетом скорректированного риска.
Рекомендации по реализации
- Требуются экспертные знания в области молекулярной биологии по проектированию праймеров для ПЦР и подбору рестриктаз.
- Необходимо наличие амплификаторов, систем электрофореза в агарозном геле и оборудования для УФ-визуализации.
- Требуется стандартизация условий лизиса тканей и ПЦР для всех пользователей для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Возможность адаптации к альтернативным модельным системам зависит от контекста последовательности и совместимости с рестриктазами.
- Метод ограничен мутациями, которые изменяют или создают сайт распознавания рестриктазы; для бесшумных мутаций могут потребоваться альтернативные стратегии.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
