Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Daisuke Shimura; Jennifer Hunter; Makoto Katsumata; Robin M. Shaw

doi:10.3791/63405

Удаление внутреннего трансляционного стартового участка из мРНК при сохранении экспрессии полнора...

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Удаление внутреннего трансляционного стартового участка из мРНК при сохранении экспрессии полноразмерного белка

Full Text

3,040 Views

05:48 min

March 16, 2022

DOI: 10.3791/63405-v

Daisuke Shimura¹, Jennifer Hunter¹, Makoto Katsumata², Robin M. Shaw¹

¹Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute,University of Utah, ²Department of Biomedical Sciences,Cedars-Sinai Medical Center

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This protocol outlines a method for genotyping animals with a single M213L mutation in the Gja1 gene that leads to the production of full-length Connexin43 while preventing the translation of the smaller GJA1-20k isoform. The method emphasizes the efficiency and cost-effectiveness of using restriction enzymes with PCR-based genotyping.

Key Study Components

Research Area

Genetics
Molecular Biology
Animal Models

Background

Importance of identifying genetic mutations
Challenges of single residue substitutions
Application of restriction enzymes in genotyping

Methods Used

PCR-based genotyping
Mouse models with point mutations
Agarose gel electrophoresis for DNA analysis

Main Results

Successful identification of genotypes with distinct banding patterns
High success rates in generating founder animals
Validated efficiency of the described methods for genetic analysis

Conclusions

The study demonstrates an efficient protocol for genotyping mutations in mouse models.
It contributes valuable methodologies for genetic research in developmental biology.

Frequently Asked Questions

What is the significance of the M213L mutation in Gja1?

The M213L mutation allows for the full-length production of Connexin43, which is crucial for proper cellular communication.

How does the protocol improve genotyping efficiency?

By incorporating a restriction enzyme step, the protocol simplifies the genotyping process and reduces costs.

What model system is used in this study?

The study utilizes transgenic mouse models to analyze genetic mutations.

What are the key steps in the genotyping process?

The key steps include tissue lysis, PCR amplification, and agarose gel electrophoresis.

How long can the tissue lysate be stored before PCR?

The tissue lysate can be stored at 4 degrees Celsius for up to a week before PCR analysis.

What temperatures are required for the thermal cycler during the protocol?

The thermal cycler must be programmed for tissue lysis and PCR amplification, with specific temperature profiles defined in the text.

What was the success rate of the injections performed in this study?

The study reports a 76.9% success rate for injecting specific concentrations of donor oligos.

Настоящий протокол описывает одну мутацию M213L в Gja1, которая сохраняет полноразмерную генерацию Connexin43, но предотвращает трансляцию меньшей изоформы GJA1-20k с внутренней трансляцией.

Трудность с заменой одного остатка заключается в эффективном генотипировании животных, несмотря на разницу в единичном остатке. Специальное использование фермента рестрикции добавляет только один, быстрый и недорогой шаг к типичному генотипированию на основе ПЦР. Этот протокол может быть применен к любой другой мышиной модели с точкой мутации, если целевая последовательность распознается ферментом рестрикции, что обычно и происходит.

Отрежьте один-три миллиметра кончика хвоста чистыми ножницами и переложите его в 0,2-миллилитровую восьмиполосную ПЦР-трубку. После хранения образца хвоста, как описано в рукописи, храните его при Т-минус 20 градусах Цельсия до извлечения, примерно до недели. Добавьте 100 микролитров раствора лизиса тканей на пробирку и хорошо перемешайте, а затем открутите вниз с помощью настольной миницентрифуги при 2, 200 раз G в течение 10 секунд при комнатной температуре.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos