Оптическая очистка тканей растений для флуоресцентной визуализации

Этот метод может быть полезен в визуализации всего растения, чтобы выявить интактную морфологию, процессы развития и взаимодействия растений и микробов. Основным преимуществом этой методики является то, что мы можем непосредственно наблюдать внутреннюю часть тела растения, не нанося ему вреда. Поскольку этот метод применим к широкому спектру видов и тканей растений, он может помочь ускорить открытие новых явлений в биологических исследованиях растений.

Фиксация является критическим шагом в этой процедуре. Перед этапом очистки нужно проверить интенсивность флуоресцентного белка после фиксации. Начать погружать образцы растений в фиксирующий раствор в микропробирке и следить за тем, чтобы объем фиксирующего раствора более чем в пять раз превышал объем образца.

Запечатайте микротрубку парапленкой и сделайте отверстия с помощью иглы. Поместите микротрубку в осушитель и медленно отрегулируйте степень вакуума примерно до 690 миллиметров ртутного столба, чтобы из образцов постепенно появлялись пузырьки. Выключите вакуумный насос после эвакуации осушителя.

Осторожно проветривайте высушивайте, не нарушая образцы. Снова включите вакуумный насос и выключите его после эвакуации осушителя. Осторожно откройте осушитель, не натыкаясь на фиксирующий раствор в микропробирке.

Удалите фиксирующий раствор и добавьте 1x PBS с микропипеткой. После хранения в течение одной минуты замените старую PBS на новую 1x PBS. После удаления ПБС в пять раз больше объема образца очищающего раствора, запечатайте микротрубку парапленкой и сделайте отверстия иглой.

Поместите образцы в осушитель. Эвакуируйте и выключите вакуумный насос. Осторожно откройте осушитель, затем закройте микропробирку.

Инвертируйте микротрубку каждые один-два дня, чтобы ускорить процесс очистки. Для распорной рамы вырежьте силиконовый резиновый лист лезвием бритвы, регулируя толщину силиконового резинового листа в соответствии с толщиной образца. Поместите силиконовую раму на покровное стекло, затем поместите обработанные образцы в раму и добавьте около 100 микролитров очищающего раствора, чтобы удалить любые пузырьки.

Накройте другим покровным стеклом, чтобы предотвратить испарение очищающего раствора. Наблюдайте за образцами под флуоресцентным микроскопом. После наблюдения возвращают образцы к очищающему раствору в микропробирке.

Фиксированные листья различных видов инкубировали в PBS или ClearSee в течение восьми дней, в ClearSee или ClearSeeAlpha в течение двух дней. ClearSee может очищать листья различных видов. После извлечения кутикуляра ClearSee может очистить листья риса.

Поскольку компонент сульфита натрия в ClearSeeAlpha предотвращает окисление полифенолов из-за восстановительного эффекта, ClearSeeAlpha может очищать плитки табака и тирании без какой-либо коричневой пигментации. Убиквитин-10 промотора H2B-mClover листья арабидопсиса талианы обрабатывали PBS или ClearSee в течение трех дней. Обработка ClearSee уменьшала бледно-зеленый цвет листа арабидопсиса H2B-mClover и усиливала интенсивность флуоресценции H2B-mClover по сравнению с инкубацией PBS.

Обработанные ClearSee листья наблюдали с помощью двухфотонной микроскопии возбуждения с 950-нанометровым возбуждением. Клеточная стенка окрашена кальцийно-белым цветом. Ядра помечены промотором убиквитина-10, H2B-mClover.

Изображения Y Z и X Z представляют собой поперечные сечения в положении, обозначенном белыми пунктирными линиями. Приготовление фиксирующего раствора важно для фиксации образцов. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы предотвратить повреждение образцов в вакууме.

Микроскопическая визуализация может быть выполнена для изучения множественных паттернов экспрессии генов и внутриклеточных коммуникаций во время развития растений и инфекции после этой процедуры.