Подход in vitro к изучению митохондриальной дисфункции: модель Cybrid
9 марта 2022 г.
Транспамохондриальные цибриды представляют собой гибридные клетки, полученные путем слияния митохондриальной ДНК (мтДНК)-истощенных клеток (rho0 клеток) с цитопластами (энуклеированными клетками), полученными от пациентов, страдающих митохондриальными нарушениями. Они позволяют определить ядерное или митохондриальное происхождение заболевания, оценить биохимическую активность и подтвердить патогенетическую роль вариантов, связанных с мтДНК.
Кибергенерация по-прежнему является современным протоколом для понимания патогенной роли любой новой мутации митохондриальной ДНК и корреляции процента атриплазмы с тяжестью заболевания. Данная методика позволяет проводить биохимическое исследование в однородной ядерной системе, в которой отсутствует вклад ядерного фона пациента. Этот метод позволяет проверить патогенность мутации митохондриальной ДНК.
и дает возможность изучить его влияние на биохимическом уровне Мыть 35-миллиметровую посуду, содержащую фибробласты, дважды, используя два миллилитра 1X PBS без кальция и магния. Очистите внешнюю поверхность посуды 70% этанолом, и подождите, пока спирт испарится. Снимите крышки с посуды и завинчивающиеся крышки с бутылок.
Поместите каждое блюдо без крышки вверх ногами на дно каждой бутылки центрифуги объемом 250 миллилитров. Медленно добавляйте 32 миллилитра нуклеационной среды в каждую бутылку, позволяя среде войти в чашку и войти в контакт с клетками. Удалите все пузырьки с посуды с помощью длинной стеклянной пастбищной пипетки, искривив кончик в пламени Бунзена.
Закройте каждую бутылку винтовой крышкой и перенесите их в центрифугу. Центрифуга в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и 8 000 х Г.Аспирируйте среду из бутылок и выбрасывайте ее. Снимите посуду, перевернув флаконы на стерильной марле, предварительно опрысканной 70% этанолом.
Очистите внешнюю поверхность посуды и ее крышек 70% этанолом и закройте посуду после того, как этанол испарится. Перед началом проверьте образование цитопласта с помощью инвертированного микроскопа для живых клеток. Ищите чрезвычайно вытянутые фибробласты из-за экструзии их ядер, индуцированных цитохалазином.
К каждой 35-миллиметровой тарелке добавьте 1 000, 143 рядных нулевых ячеек. Повторно суспендируется в двух миллилитрах питательной среды, дополненной 5% FBS. Оставьте посуду на три часа в увлажненном инкубаторе углекислого газа, чтобы поселить 143 рядные нулевые клетки на призраках.
После трех часов инкубации аспирировать и выбросить среду. Дважды промыть клетки адгезии двумя миллилитрами среды DMEM с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или MEM, затем аспирировать и выбросить среду. Добавьте в клетки 500 микролитров раствора полиэтиленгликоля и инкубируйте ровно одну минуту.
Аспирировать и выбросить раствор полиэтиленгликоля. Промыть клетки три раза двумя миллилитрами ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или с ПОМОЩЬЮ МЭМ. Добавьте два миллилитра термоядерной среды и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.
Попробуйте клетки в оставшихся чашках культуры Подсчитайте их и посейте в одну или несколько чашек Петри Добавьте от 50 до 100 клеток на чашку в дополненной культуре, пока не появятся клоны. Затем дайте им расти в течение нескольких дней. С помощью стереомикроскопа подберите клонов из чашки Петри с помощью клонирующих цилиндров или наконечника пипетки.
Старайтесь избегать объединения различных клонов и переносите их на плиту из 96 скважин, каждая из которых содержит 200 микролитров дополненной питательной среды. Цибриды были получены, начиная с фибробластов, полученных от пациента, несущего гетероплазматический M2343A2G Одна из наиболее распространенных мутаций митохондриальной ДНК, связанных с митохондриальной миопатией, энцефалопатией, лактоацидозом и инсультоподобными эпизодами. Анализ переменного числа тандемных повторов показал, что кибер-ДНК идентична нулевым клеткам ряда, что подтверждает замену кибер-ДНК пациента геномом 143 B.
Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента, или анализ секвенирования, может быть использован для оценки наличия мутации митохондриальной ДНК и процента гетероплазмы. При попытке этого протокола важно проверить правильный генетический актив нуклонной и митохондриальной ДНК, а также количество митохондриальной ДНК в повторно заселенных цибридах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Трансмитохондриальные цибриды представляют собой гибридные клетки, созданные путем слияния клеток, обедненных мтДНК, с цитопластами пациентов с митохондриальными заболеваниями. Данный подход позволяет определить этиологию заболеваний и оценить биохимическую активность.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Митохондриальная генетика
Введение
- Трансмитохондриальные гибриды (цибриды) имеют важное значение для изучения митохондриальных заболеваний.
- Они позволяют анализировать вклад ядерного и митохондриального геномов в развитие болезни.
- Данный метод имеет решающее значение для подтверждения патогенности мутаций мтДНК.
- Понимание биохимического воздействия мутаций жизненно важно для лечения заболеваний.
Цель исследования
- Изучение патогенной роли новых мутаций митохондриальной ДНК.
- Корреляция процента гетероплазмии с тяжестью заболевания.
- Проведение биохимических исследований в контролируемой ядерной среде.
Используемые методы
- Слияние клеток rho 0 с энуклеированными цитопластами.
- Биохимические анализы для оценки функции митохондрий.
- Валидация мутаций мтДНК с помощью анализа цибрид.
- Использование PBS и этанола для подготовки клеток.
Основные результаты
- Успешное создание трансмитохондриальных гибрид.
- Идентификация биохимической активности, связанной с мутациями мтДНК.
- Установление корреляции между уровнями гетероплазмии и исходами заболевания.
- Подтверждение патогенной роли специфических вариантов мтДНК.
Заключение
- Трансмитохондриальные гибриды (цибриды) эффективны для изучения митохондриальных заболеваний.
- Данный метод углубляет понимание мутаций мтДНК и их последствий.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для разработки таргетной терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Модели трансмитохондриальных гибрид (цибрид) позволяют точно разграничить вклад митохондриальных и ядерных генетических факторов в дисфункцию OXPHOS, что является критически важным аспектом в исследованиях митохондриальных заболеваний. Данный подход обеспечивает механистическое снижение рисков и валидацию мишеней для мутаций митохондриальной ДНК, повышая прогностическую достоверность на ранних этапах поиска и в трансляционных исследованиях. Способность системы цибрид изолировать и характеризовать патогенность служит основой для принятия взвешенных решений по управлению портфелем программ изучения митохондриальных расстройств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать патогенность мутаций митохондриальной ДНК в контролируемом ядерном фоне.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем разграничения дефектов OXPHOS, вызванных мтДНК и яДНК.
- Способствует механистическому снижению рисков при изучении новых митохондриальных вариантов перед дальнейшими инвестициями.
- Предоставляет платформу для корреляции уровней гетероплазмии с фенотипами, имеющими значение для заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создавать валидированные линии цибрид для воспроизводимых биохимических и генетических анализов.
- Обеспечивает количественную оценку активности OXPHOS и влияния мутаций.
- Служит основой для стандартизации анализов и обеспечения межлабораторной воспроизводимости в исследованиях митохондрий.
- Позволяет подготавливать надежные клеточные системы для скрининга соединений, направленных на коррекцию митохондриальной дисфункции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет релевантные заболеванию модели цибрид с разработкой трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от генетического открытия до доклинической валидации митохондриальных мишеней.
- Позволяет осуществлять риск-ориентированное продвижение потенциальных методов лечения на основе механистических доказательств.
- Поддерживает прогностическое снижение рисков для портфелей препаратов при митохондриальных заболеваниях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Модель цибрид интегрируется в континуум от поиска мишени до доклинических исследований, позволяя проводить проверку гипотез, валидацию мишеней и уточнение механизмов развития митохондриальных заболеваний.
- Открытия в биологии: Поддерживает проверку нулевой гипотезы о патогенности мутаций мтДНК и проясняет генетические механизмы дисфункции OXPHOS.
- Скрининг: Предоставляет стандартизированные, воспроизводимые линии цибрид для количественных биохимических анализов.
- Аналитика: Обеспечивает количественные показатели гетероплазмии и активности OXPHOS для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Связывает генетические открытия с валидацией на доклинических моделях и согласованием биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает многократно используемую платформу для постоянного поиска митохондриальных мишеней и биомаркеров.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов и снижает механистическую неоднозначность в исследованиях митохондриальных заболеваний.
- Операционная ценность: Стандартизирует создание и характеристику цибрид для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно управлять портфелем активов.
- Влияние на портфель: Способствует приоритезации с учетом рисков и продвижению программ по изучению митохондриальных расстройств.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области слияния клеток, генетики митохондрий и разработки биохимических методов анализа.
- Необходим доступ к специализированной инфраструктуре для культивирования клеток, центрифугирования и молекулярного анализа.
- Требуется строгая standardization протоколов создания и валидации цибрид между исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация для различных типов клеток или генетических фонов, соответствующих конкретным заболеваниям.
- Для обеспечения достоверности модели обязательна верификация ядерного и митохондриального генетического материала.
