Измерение содержания негемового железа в тканях с помощью колориметрического анализа на основе батофенантролина
31 января 2022 г.
Здесь представлен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием простого, хорошо зарекомендовавшего себя колориметрического анализа, который может быть легко реализован в большинстве лабораторий.
Здесь мы предоставили протокол для измерения негемового содержания в тканях животных. Использование простого хорошо зарекомендовавшего себя колориметрического анализа, который может быть легко реализован в большинстве лабораторий. Колориметрический анализ на основе батофенантролина не требует сложных навыков или дорогостоящего оборудования и может быть адаптирован к формату микропластин для более высокой пропускной способности образца и экономической эффективности.
Этот протокол подходит для обнаружения изменений в уровнях железа в тканях в различных экспериментальных моделях перегрузки железа на животных или эффективности железа. Начните с разрезания образца ткани весом от 10 до 100 граммов лезвием скальпеля. Точно взвесьте его в аналитических весах над небольшим кусочком парапленки.
Используйте пластиковый пинцет, чтобы поместить кусок ткани в 24-луночную пластину. Дайте ему высохнуть на стандартном инкубаторе при 65 градусах Цельсия в течение 48 часов. В качестве альтернативы поместите кусочек салфетки с помощью пинцета в безжелезненную тефлоновую чашку и высушите ее в лабораторной микроволновой печи для сбраживания.
Поместите каждый высушенный кусочек ткани на небольшой кусочек параформы внутри аналитических весов и точно взвесьте его. Переложите каждый высушенный кусочек ткани в микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра. Добавьте в трубку литую кислотную смесь и закройте ее.
Приготовьте кислотную заготовку таким же образом, за исключением того, что ткань здесь опущена. Инкубируйте трубки при температуре 65 градусов цельсия в течение 20 часов, чтобы переварить ткань. После охлаждения до комнатной температуры используйте микропипетку, оснащенную пластиковыми наконечниками, для переноса 500 микролитров прозрачного кислотного экстракта в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Подготавливают хромогенные реакции непосредственно в плоское дно 96-луночных, прозрачных необработанных полистирольных микропластин. Инкубируют комнатной температуры в течение 15 минут. Измерьте поглощение образца в пластинчатом считывателе на длине волны 535 нанометров по отношению к деионизированному эталону воды.
Здесь показано определение негемового железа с помощью кюветы и колориметрических анализов на основе 96-луночных микропластин. Здесь показана корреляция между уровнями негемового железа на основе кюветы и микропластинки в 55 образцах тканей шестимесячных самцов черного, шести мышей, включая печень, селезенку, сердце, легкие и костный мозг. Высокая корреляция между двумя методологиями указывает на то, что метод на основе микропластин является действительной альтернативой оригинальному методу на основе кюветы.
Наконец, уровни негемового железа были количественно определены методом на основе микропластинчат после кислотного переваривания образца, полученного из тех же тканей либо смесью соляной кислоты и трихлоруксусной кислоты, либо только соляной кислотой. Высокая корреляция показывает, что трихлоруксусная кислота может выделяться из кислотного пищеварения. Репрезентативное изображение показывает уровни негемового железа в печени, селезенке, сердце и поджелудочной железе самцов черных шести мышей дикого типа и самцов нокаутирующих мышей гепцидина на черном шести генетическом фоне, измеренном с помощью колориметрического анализа на основе батофенантролина.
Нарушение гепцидина приводит к гемохроматозу, подобному фенотипу отложения железа с тяжелым накоплением железа в печени, поджелудочной железе и сердцем и истощением селезеночного железа. Здесь показаны уровни печеночного негемового железа у молодых самок европейского морского окуня после экспериментальной модуляции железа. Уровень железа в печени значительно увеличился у животных, получавших железо.
В то время как анемия вызывала умеренное снижение запасов печеночного железа. Репрезентативные изображения показывают уровни негемового железа у месячной дрозофилы, измеренные с помощью колориметрического анализа на основе батофенантролина. Результаты показывают содержание негемового железа в каждом бассейне из 20 мух или предполагаемое содержание железа в каждой мухе.
Учитывая средний вес 0,64 миллиграмма на муху. При попытке этой процедуры не забудьте тщательно очистить весь износ стекла и не позволяйте металлическим лабораторным материалам вступать в контакт с каким-либо реагентом или раствором из-за риска загрязнения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол определения содержания негемового железа в тканях животных с помощью колориметрического анализа. Метод прост в исполнении и может быть реализован в большинстве лабораторий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Физиология животных
Теоретические сведения
- Негемовое железо играет важную роль в различных биологических процессах.
- Измерение уровней железа позволяет изучить механизмы перегрузки железом и его дефицита.
- Данный метод анализа адаптируем для различных лабораторных условий.
- Он подходит для различных экспериментальных моделей животных.
Цель исследования
- Обеспечение надежного метода оценки уровня железа в тканях.
- Облегчение исследований метаболизма железа на моделях животных.
- Обеспечение возможности проведения высокопроизводительного анализа образцов тканей.
Используемые методы
- Колориметрический анализ с использованием батофенантролина.
- Подготавливают образцы тканей массой от 10 до 100 г.
- Образцы точно взвешивают на аналитических весах.
- Метод может быть адаптирован для использования в формате микропланшетов.
Основные результаты
- Метод обеспечивает точные измерения негемового железа.
- Он эффективен для обнаружения изменений уровня железа в тканях.
- Протокол удобен в использовании и экономически выгоден.
- Высокая пропускная способность образцов достигается при адаптации метода для микропланшетов.
Выводы
- Данный протокол является ценным инструментом для исследователей, изучающих метаболизм железа.
- Его можно внедрить в различных лабораторных условиях.
- Этот метод может быть использован в будущих исследованиях для более широкого применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное измерение негемового железа в тканях имеет решающее значение для снижения рисков на ранних этапах программ по поиску лекарственных средств, сосредоточенных на метаболизме железа и связанных с ним патологиях. Колориметрический анализ на основе батофенантролина обеспечивает масштабируемую и воспроизводимую оценку статуса железа в доклинических моделях, что способствует валидации мишеней и проведению механистических исследований. Доступность и высокая пропускная способность данного метода позволяют эффективно проводить отбор приоритетных направлений портфеля и обеспечивать трансляционную преемственность в различных экспериментальных системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает точное количественное определение негемового железа для изучения механизмов гомеостаза железа.
- Поддерживает функциональную валидацию генетических или фармакологических воздействий на животных моделях.
- Способствует снижению механистических рисков за счет разграничения пулов негемового и гемового железа.
- Предоставляет практически значимые данные для приоритизации мишеней, вовлеченных в процессы перегрузки или дефицита железа.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые результаты, подходящие для конвейеров разработки анализов.
- Адаптация под микропланшеты увеличивает пропускную способность при проведении кампаний по скринингу соединений или генетическому скринингу.
- Количественные показатели абсорбции позволяют проводить надежное сравнение между различными экспериментальными условиями.
- Гибкость анализа поддерживает интеграцию в различные платформы для скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям перегрузки и дефицита железа при заболеваниях для трансляционных исследований биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет поддержки межвидового анализа.
- Предоставляет количественные конечные точки для принятия решений о продвижении проектов по коррекции обмена железа с учетом рисков.
- Поддерживает механистические исследования на генетически модифицированных или фармакологически обработанных моделях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный колориметрический анализ применим на всех этапах — от раннего поиска до доклинических исследований, что позволяет проводить проверку гипотез, валидацию мишеней и трансляционные исследования метаболизма железа.
- Фундаментальная биология: обеспечивает возможность проверки гипотез при исследовании путей регуляции обмена железа на моделях животных.
- Скрининг: предоставляет масштабируемые результаты, готовые для использования в анализах при скрининге соединений или генетических модификаторов.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные по абсорбции для достоверного статистического сравнения уровней железа в тканях.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию биомаркеров и межвидовой валидации в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Корпоративное использование: представляет собой широко применимую и экономически эффективную платформу для количественного определения железа в различных программах НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность валидации мишеней и механистических исследований метаболизма железа.
- Операционная ценность: Стандартизирует измерение содержания железа в тканях с помощью масштабируемых и воспроизводимых рабочих процессов.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях в портфелях препаратов, связанных с обменом железа.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с поправкой на риск и продвижение активов на стадиях поиска и доклинических исследований.
Особенности реализации
- Требуются базовые лабораторные навыки и стандартное аналитическое оборудование, такое как микропланшетные ридеры.
- Для обеспечения целостности данных необходима тщательная очистка стеклянной посуды и предотвращение загрязнения металлами.
- Обеспечивается стандартизация между различными исследовательскими группами за счет валидированных протоколов и количественных результатов.
- Метод адаптируем к различным моделям животных и типам тканей при минимальной модификации протокола.
- Пропускная способность и масштабируемость ограничены только имеющимися мощностями планшетного ридера и ресурсами для подготовки образцов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Sample Drying
1:33
Sample Acidic Digestion
2:11
Color Development and Absorbance Reading
2:36
Results: Cuvette Versus 96-Well Microplate Comparison, Measurement of Non-Heme Iron Levels in a Mouse Model of Genetic Hemochromatosis, in Sea Bass Liver, and Whole Drosophila melanogaster
4:41
Conclusion
