Естественная трансформация, экспрессия белка и криоконсервация нитевидной цианобактерии Phormidium lacuna

Этот протокол описывает, как нитевидные цианобактерии, принадлежащие к осцилляториалам, могут быть преобразованы естественным превращением. Он также показывает, как можно изучать различные виды движения. Естественная трансформация является простейшей техникой преобразования, если она работает.

Требуются только ДНК, клетки и среда роста. До сих пор ни один другой член осцилляториалов не мог быть преобразован естественным преобразованием. Мы надеемся, что наши исследования стимулируют другие группы пробовать другие осциллятории.

Для трансформации создайте хорошую, здоровую культуру и хороший препарат ДНК. Для исследований движения всегда используйте культуру, обработанную ультразвуком. Лечение должно быть свежим.

Продемонстрировать процедуру будет Нора Вебер, техник из моей лаборатории. Начните с инокуляции 50 миллилитров жидкой среды F2 в каждую из двух 250-миллилитровых колб с одним миллилитрами нитей P.lacuna из бегущей культуры. Культивируйте в белом свете под волнением около пяти дней при 25 градусах Цельсия.

Через пять дней гомогенизируйте 100 миллилитров клеточной суспензии P.lacuna при 10 000 об/мин в течение трех минут и измерьте оптическую плотность на 750 нанометрах. Затем центрифугируют клеточную суспензию в течение 15 минут в 6 000 раз G.Удалите супернатант и суспендируйте гранулу в 800 микролитрах оставшейся жидкости и дополнительной F2+среды. Возьмите восемь пластин агара F2 + Bacto, содержащих 120 микрограммов на миллилитр канамицина, и пипетку 10 микрограммов ДНК в середину каждой агаровой пластины.

Сразу же пипетка 100 микролитров клеточной суспензии поверх ДНК. Держите агаровую пластину без крышки на чистой скамье, чтобы дать лишней жидкости испариться. Закройте тарелку и культивируйте ее при белом свете при 25 градусах Цельсия в течение двух дней.

Через два дня распределите нити каждой агаровой пластины на несколько свежих агаровых пластинок F2+Bacto, содержащих 120 мкг на миллилитр канамицина с помощью петли инокуляции. Культивируйте пластины в белом свете при 25 градусах Цельсия и регулярно проверяйте культуры под микроскопом. Через 14-28 дней определите мертвые коричневатые нити и найдите трансформированные нити под микроскопом.

Трансформированные нити выглядят здоровыми и зелеными и отличаются от основной массы нитей. Переведите каждую преобразованную нить в 50-миллилитровые колбы с 10 миллилитрами F2+ среды с 250 микрограммами на миллилитр канамицина. Культивируйте в белом свете при 25 градусах Цельсия на шейкере и наблюдайте за ростом до четырех недель.

Перенесите нити обратно в агаровую среду, содержащую 250 мкг на миллилитр канамицина, и дождитесь роста нитей. Затем снова увеличьте концентрацию канамицина, чтобы ускорить сегрегацию. Для экспрессии GFP наблюдает одиночные нити с помощью флуоресцентного микроскопа с увеличением 40X или 63X и захватывает изображение передачи яркого поля и флуоресцентное изображение.

Культивируйте P.lacuna в среде F2 при горизонтальном перемешивании 50 об/мин в белом свете в течение примерно пяти дней, пока расчетная оптическая плотность при 750 нанометрах не станет 0,35. Храните образец при четырех градусах Цельсия. Гомогенизируйте нити ультразвуком в течение одной минуты при максимальной мощности и цикле одного.

Измерьте оптическую плотность в 750 нанометров и перенесите восемь миллилитров среды, содержащей P.lacuna, в шестисантиметровую чашку Петри. Подождите несколько минут, пока образец не достигнет комнатной температуры, а затем накройте чашку Петри целлофановой фольгой. Поместите слайд микроскопа на стол X-Y стандартного микроскопа с камерой.

Включите свет микроскопа и переместите объектив 4X или 10X на траекторию света. Затем поместите чашку Петри на горку. Отрегулируйте одиночные нити накаливания или связки нитей с помощью движений X, Y и Z таблицы.

Наблюдайте за движениями отдельных нитей или пучков и записывайте движения с помощью стандартной камеры микроскопа. Убедитесь, что объектив не касается жидкости. Пипетка 0,5 миллилитра раствора, содержащего P.lacuna на поверхности агара Бакто шестисантиметровой чашки Петри.

Позвольте жидкости проникнуть на поверхность. Примерно через 20 минут закройте чашку Петри и наблюдайте за движением нитей на поверхности с помощью объектива 4X или 10X. Снимайте покадровые записи с помощью окулярной камеры и мини-компьютерной системы.

Нити должны быть сначала сфокусированы глазом, а затем через глазную камеру. Убедитесь, что интервал времени между последующими изображениями составляет от пяти секунд до одной минуты. Запрограммируйте Linux-скрипт мини-компьютера для управления записью таймлапса.

Подготовьте светодиодные держатели, где установлены пятимиллиметровые светодиоды для облучения площади 20-миллиметрового квадрата снизу вверх. Измерьте и отрегулируйте интенсивность светодиодов. Убедитесь, что вся обстановка находится в темной комнате или в закрытом, темном контейнере.

Поместите восемь миллилитров среды, содержащей P.lacuna, в шестисантиметровую чашку Петри, закройте чашку Петри крышкой и поместите ее на светодиодный держатель так, чтобы светодиод находился в центре чашки Петри. Обычно через два дня снимайте изображение чашки Петри с помощью камеры смартфона, направленной непосредственно на положение световой обработки. Используйте держатель и белый лист в качестве фона, чтобы обеспечить одинаковое расстояние и условия освещения для каждого изображения.

Откройте программное обеспечение ImageJ, нажмите «Файл», «Открыть» и выберите файл. Затем нажмите Enter. Выберите прямую кнопку и нажмите левую кнопку мыши, чтобы провести линию от одного конца чашки Петри до противоположного конца.

Убедитесь, что линия проходит через центр круга нитей. Нажмите «Анализировать и измерять», чтобы увидеть длину чашки Петри. Затем нажмите «Анализ и построение профиля» в меню ImageJ.

Оцените среднее значение интенсивности пикселей за пределами круга и другое среднее значение интенсивности пикселей внутри круга. Наведите указатель мыши на положение Y между этими значениями, чтобы оценить значения X обеих сторон окружности. Запишите оба значения и рассчитайте разницу.

Затем выберите прямую кнопку и нарисуйте линию в среднем максимальном значении интенсивности пикселей. Наконец, нажмите «Анализировать», а затем «Измерить», чтобы получить длину внутреннего клеточного круга. Здесь показана интеграция и сегрегация вставки после преобразования P.lacuna с PAK1.

ПЦР-тест с внешними праймерами примерно через неделю после трансформации обычно имеет две полосы на геле электрофореза, одну с размером полосы дикого типа и одну более медленную мигрирующую полосу, которая указывает на вставку кассеты сопротивления. Здесь полосы 1-4 представляют продукты ПЦР нитей через семь дней, 11 дней, 14 дней и 17 дней выделения резистентной нити, а полоса 5 представляет продукт ПЦР дикого типа. В семидневном образце вставка присутствует в небольшой части хромосом.

Эта доля увеличивается до 17 дней, когда не видна полоса дикого типа, то есть сегрегация завершена. Данное изображение представляет вектор pMH1 для экспрессии sfGHP под контролем эндогенного бета-промотора фикоцианина. Здесь показаны гомологичная последовательность P.lacuna, векторная основа pUC19 и вставка с резистентностью к sfGFP и канамицину.

В pMH1 ген sfGHP помещается в три простых числа бета-гена фикоцианина; следовательно, он управляется эндогенным бета-промотором cpc. Здесь показаны флуоресцентные изображения нитей дикого типа P.lacuna и после трансформации с PAK1, PAK2, PAK3 и pMH1. Экспрессия sfGFP управляется промотором cpc 560, промотором a2813, промотором psbA2S или эндогенным бета-промотором cpc.

Объединенные изображения, представленные здесь, показывают подвижность лакуны Phormidium. Движение по поверхности агара показано здесь. Временной интервал составлял одну минуту.

Здесь представлено движение в жидкой среде. Временной интервал составлял 10 секунд. Естественная трансформация – это простой метод.

Просто смешайте плазмидную ДНК с кассетой сопротивления в гомологичных последовательностях с клетками и позвольте клеткам расти на среде с антибиотиками. Гены могут быть инактивированы, а белки могут быть переэкспрессированы. Это важно для любых фундаментальных исследований и для биотехнических исследований.

В одноклеточных цианобактериях, где также установлена естественная трансформация, были рассмотрены молекулярные исследования фотосинтеза или фоторецепторов и т. Д.