Модель грызунов, индуцированная TNBS, для изучения патогенной роли механического стресса при болезни Крона
1 марта 2022 г.
Настоящий протокол описывает развитие модели колита, подобной модели колита Крона, у грызунов. Трансмуральное воспаление приводит к стенозу в месте инстилляции ТНБС, а механическое увеличение наблюдается в сегменте, близком к стенозу. Эти изменения позволяют изучать механические нагрузки при колите.
Таким образом, в нашем протоколе внутриколониальная инстилляция TNBS приводит к трансмуральному воспалению в месте инстилляции и механическому растяжению в сегменте, близком к воспалению. Таким образом, это имитирует стенотическую болезнь Крона. Поскольку проксимальный сегмент механически растянут, но не показывает видимого воспаления, сравнительное исследование проксимального сегмента и места воспаления помогает определить, играет ли механическое напряжение роль в колите Крона.
Предыдущие исследования сосредоточены только на месте воспаления. Наш протокол, работающий на разных участках в модели, подчеркивает критическую роль механического стресса в болезни Крона, особенно при стенозирующей болезни Крона. Для начала поместите крыс на стол для анестезии в лежачем положении.
Чтобы вызвать колит, вставьте полиуретановый катетер медицинского класса с открытым концом через анус примерно на семь-восемь сантиметров от анальной грани и осторожно закапывайте TNBS в толстую кишку. Вводите фиктивный контроль крысам с 250 микролитрам физиологического раствора. Чтобы помочь распределению TNBS или физиологического раствора и избежать разливов, держите крыс в лежачем положении с головой, обращенной вниз примерно под углом 30 градусов, с закрытым анусом в течение двух минут.
Откройте брюшко крысы с помощью хирургических ножниц и щипцов. Осторожно удалите всю толстую кишку над анальным каналом и немедленно перенесите толстую кишку в ледяной буфер HBSS 1x. Выпрямите двоеточие в буфере и измерьте длину двоеточия с помощью линейки.
Возьмите нейлоновую нить и обведите ее вокруг толстой кишки, чтобы измерить внешнюю окружность сегментов толстой кишки у контрольных и обработанных TNBS крыс. Возьмите ткани полной толщины для гистологии. Разрежьте толстую кишку вдоль брыжеечной доски и тщательно очистите толстую кишку буфером HBSS.
Оцените оценку толстой кишки на основе макроскопического воспаления на основе предопределенных критериев с минимальными изменениями. Соберите образцы ткани толстой кишки у крыс, обработанных TNBS, в местах P, I и D.Site P - это часть за два-три сантиметра до орального края места воспаления. Участок I - это место воспаления, где закапывается TNBS, обычно в четырех-шести сантиметрах от конца толстой кишки.
Наконец, участок D представляет собой участок от одного до двух сантиметров дистальнее аборального края участка воспаления. Внутриколониальная инстилляция ТНБС у крыс вызывала локализованное трансмуральное воспаление длиной около двух сантиметров с утолщенной стенкой кишечника и суженным просветом в месте закапывания в дистальной части толстой кишки. Место инстилляции TNBS было названо участком I.As результатом трансмурального воспаления и стеноза, как воспаление, так и механическое напряжение присутствовали в месте I.Стеноз в месте I привел к выраженному растяжению просвета в сегменте, близком к месту инстилляции TNBS, называемом сайтом P. Окружность толстой кишки была значительно увеличена в сайтах P и I по сравнению с фиктивной контрольной толстой кишкой.
Несмотря на механическое растяжение, участок P не показывал видимого воспаления. Напротив, сегмент толстой кишки дистальнее инстилляции ТНБС, называемый участком D, не представлял ни воспаления, ни механического растяжения. Макроскопическая оценка воспаления в месте I у крыс, получавших TNBS, была резко увеличена по сравнению с фиктивной контрольной группой на участках P и D крыс с колитом.
Показатели воспаления в местах P и D не были значительно увеличены по сравнению с фиктивными. Поэтому важно изучать не только участок I, но и участки P и D в модели, так как это помогает распознать патогенное значение механического напряжения при болезни Крона. Чтобы дополнительно определить, является ли механическое напряжение патогенным фактором воспаления кишечника, можно также попытаться освободить механическое растяжение, кормя животных исключительно жидкой диетой, и посмотреть, помогает ли это с воспалением и функцией кишечника.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается разработка модели колита у грызунов, имитирующей болезнь Крона, с акцентом на трансмуральное воспаление и механический стресс. Это позволяет исследовать механические изменения при колите, в частности, при стенотических состояниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Гастроэнтерология
- Воспалительные заболевания кишечника
Теоретическая часть
- Болезнь Крона характеризуется трансмуральным воспалением.
- Механическое напряжение может играть значительную роль в прогрессировании заболевания.
- Предыдущие исследования были сосредоточены преимущественно на участках воспаления.
- Данная модель позволяет проводить сравнительные исследования пораженных и непораженных сегментов.
Цель исследования
- Разработать модель грызуна, имитирующую стенозирующую форму болезни Крона.
- Исследовать роль механического стресса при колите.
- Сравнить механические изменения в воспаленных и невоспаленных сегментах.
Используемые методы
- Интраколонное введение TNBS для индукции воспаления.
- Оценка механического растяжения проксимальных сегментов.
- Сравнительный анализ воспаленных и невоспаленных участков.
- Использование анестезии для подготовки грызунов.
Основные результаты
- В месте воздействия TNBS было успешно индуцировано трансмуральное воспаление.
- В проксимальном сегменте наблюдалось механическое растяжение.
- Результаты свидетельствуют о критической роли механического стресса при болезни Крона.
- Данная модель подчеркивает важность изучения различных анатомических участков.
Выводы
- Разработанная модель эффективна для изучения колита, подобного болезни Крона.
- Механический стресс может вносить вклад в патологию заболевания.
- В будущих исследованиях следует изучить значение этих результатов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание независимой роли механического стресса в патогенезе болезни Крона имеет решающее значение для снижения рисков на ранних этапах поиска и валидации мишеней при разработке препаратов для лечения ВЗК. Модель грызунов, индуцированная TNBS, позволяет точно разграничить механические и воспалительные факторы, что повышает прогностическую достоверность трансляционных исследований и помогает при отборе приоритетных антифибротических и антистенотических стратегий в рамках портфеля разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет исследовать механическое напряжение как независимый патогенный фактор при болезни Крона.
- Способствует функциональной валидации мишеней путем разграничения механического и воспалительного вклада в развитие фиброза и стеноза.
- Облегчает механистическую оценку рисков для новых терапевтических гипотез, направленных на ремоделирование тканей.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную систему in vivo для количественной оценки экспрессии генов, иммунного ответа и фиброза при заданных механических условиях.
- Обеспечивает воспроизводимое измерение макроскопического воспаления и механического растяжения в различных анатомических областях.
- Поддерживает стандартизацию анализа для последующей оценки соединений, воздействующих на пути механического стресса.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует доклиническим моделям с характеристиками патологии болезни Крона, имеющими клиническое значение, включая трансмуральное воспаление и просветный стеноз.
- Обеспечивает преемственность этапов от поиска до доклинической валидации антифиброзных и антистенотических методов вмешательства.
- Создает возможности для трансляционного поиска биомаркеров путем установления корреляции между механическим стрессом, экспрессией генов и ремоделированием тканей.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Эта модель связывает этап ранних открытий с доклинической валидацией, позволяя проверять гипотезы о воздействии механического стресса при ВЗК, что способствует идентификации перспективных соединений и принятию обоснованных решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков.
- Открывающая биология: Анализирует патогенное значение механического стресса в сравнении с воспалением при болезни Крона.
- Скрининг: Обеспечивает количественные, сайт-специфичные показатели воспаления, фиброза и механического растяжения.
- Аналитика: Позволяет проводить сравнительный анализ экспрессии генов и иммунного ответа в определенных анатомических зонах.
- Трансляционные исследования: Моделирует клинически значимые признаки для доклинической оценки антифибротических стратегий.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для механистических исследований и скрининга соединений в исследованиях ВЗК.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в прогнозировании при валидации мишеней и снижении механистических рисков при болезни Крона.
- Операционная ценность: стандартизирует оценку in vivo механических и воспалительных факторов в моделях ВЗК.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки антифибротических и антистенотических препаратов-кандидатов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию активов на этапах поиска и доклинических исследований, направленных на ремоделирование тканей, с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения хирургических процедур на грызунах и моделирования колита.
- Необходим доступ к инфраструктуре для гистологического, молекулярного и макроскопического анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов оценки воспаления и отбора образцов тканей.
- Может потребоваться адаптация для других линий грызунов или моделей, релевантных ВЗК.
- Количественная оценка механического стресса ограничена определенными анатомическими участками и может не охватывать системные эффекты.
