Выделение первичной микроглии мыши методом магнитно-активированной сортировки клеток на животных моделях демиелинизации
5 апреля 2022 г.
Здесь мы представляем протокол для выделения и очистки первичной микроглии на животных моделях демиелинизирующих заболеваний с использованием столбчатой магнитно-активированной сортировки клеток.
Этот протокол помогает изолировать микроглию из микродиссеченных демиелинационных поражений мозга взрослой мыши для изучения микроглиальных характеристик in vivo. Этот метод экономит время и имеет более низкие требования как к экспериментаторам, так и к оборудованию. Этот метод помогает изолировать микроглию из мозга животного, особенно тех микроразделенных тканей в различных болезненных состояниях.
Начните с микрорассекции поражений, помеченных нейтральным красителем вокруг мозолистого тела под стереомикроскопом. Центрифугируют рассеченную ткань в 300 раз в г в течение 30 секунд, чтобы собрать образец на дне пробирки. Разогреть фермент смешать один и фермент смешать от двух до 37 градусов Цельсия в инкубаторе.
Затем добавьте 1 950 микролитров предварительно нагретой ферментной смеси один к одному образцу и переварите в инкубаторе при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Добавьте 30 микролитров предварительно разогретого фермента, смешайте два и аккуратно перемешайте. После переваривания добавьте в пробирку четыре миллилитра холодного PBS и аккуратно встряхните.
Центрифугируйте образцы тканей в 300 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и медленно и полностью аспирируйте супернатант. Аккуратно повторно суспендируйте гранулу ячейки с помощью 1 550 микролитров холодного PBS. Добавьте 450 микролитров холодного раствора для удаления мусора и хорошо перемешайте их.
Используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы наложить смесь очень медленно и осторожно с двумя миллилитрами холодного PBS. Центрифугируйте смесь, а затем найдите три слоя. Используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы полностью аспирировать два верхних слоя, и заполните трубку до пяти миллилитров буфером холодной загрузки.
Аккуратно переверните трубку три раза. Далее, после центрифугирования и аспирации надосадочного вещества, повторно суспендируют ячейку гранулы с 90 микролитрами нагрузочного буфера и добавляют 10 микролитров ШАРИКОВ CD11b. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
После инкубации добавьте один миллилитр нагрузочного буфера и промыть клетки, осторожно пипетируя жидкость вверх и вниз пипеткой объемом 1000 микролитров. Центрифугируйте клетки в 300 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и полностью аспирируйте супернатант, чтобы удалить несвязанные шарики. Повторно суспендируйте ячейки в 500 микролитрах нагрузочного буфера и поместите колонну MS с ее сепаратором для положительного отбора в магнитном поле.
Промыть колонну 500 микролитрами загрузочного буфера для защиты ячеек и обеспечения эффективности магнитной сортировки на основе протокола производителя. Нанесите суспензию ячейки на столбец MS и отбросьте сквозной поток, содержащий непомеченные ячейки. Добавьте 500 микролитров загрузочного буфера для промывки колонны и извлеките ее из сепаратора.
Поместите колонну на 15-миллилитровую центрифужную трубку и добавьте в колонну один миллилитр нагрузочного буфера. Наконец, подтолкните плунжер к нижней части колонны, чтобы смыть магнитно меченые ячейки. Здесь показано схематическое представление стратегии гатинга, используемой при анализе проточной цитометрии микроглии, выделенной из демиелинизационных поражений взрослых мышей до и после магнитно-активированной сортировки клеток.
Графические изображения представляют высоту прямого рассеяния и высоту бокового рассеяния для выбора ячеек, область прямого рассеяния и высоту прямого рассеяния для выбора отдельных ячеек, а также CD11b-FITC и CD45-APC для выбора миелоидных клеток и микроглии. Доля микроглии значительно возросла после магнитно-активированной сортировки клеток. Графическое изображение представляет собой стратегию гастинга, используемую в анализе проточной цитометрии для живых и мертвых одиночных клеток после магнитно-активированной сортировки клеток.
Здесь 7-аминоактиномицин D и высота бокового рассеяния были использованы для отбора живых клеток. При попытке этой процедуры не забудьте точно микродизировать демиелинизирующие поражения под стереомикроскопом на основе нейтральных красных отметин.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этом исследовании представлен протокол по изоляции и очистке первичных микроглии из поражений демиелинизации в мозге взрослых мышей. Используя колонную магнитно-активированную сортировку клеток, метод облегчает исследование характеристик микроглии in vivo, оптимизируя при этом требования к времени и ресурсам.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Нейропатология
Фон
- Микроглии играют важную роль в нейровоспалительных и заболеваниях центральной нервной системы.
- Понимание их функции в демиелинизирующеих состояниях важно для понимания механизмов заболеваний.
- Для изучения микроглии, характеризующихся специфическими патологическими состояниями, необходимы эффективные методы изоляции.
- Представленный метод фокусируется на повышении эффективности изоляции этих клеток.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол для изоляции микроглии из целевых областей мозга.
- Способствовать исследованию поведения микроглии и их ролей в контексте демиелинизирующеих заболеваний.
- Оптимизировать использование ресурсов в процессе изоляции.
Используемые методы
- Микродиссекция ткани из поражений демиелинизации под стереомикроскопом.
- Использование колонной магнитно-активированной сортировки клеток для изоляции микроглии.
- Шаги включают переваривание ткани, центрифугирование и аккуратное повторное взвешивания для эффективной изоляции клеток.
- Ключевые шаги включают приготовление ферментов, несколько последовательностей центрифугирования и аккуратное обращение с образцами микроглии.
Основные результаты
- Протокол значительно улучшает долю изолированной микроглии.
- Анализ проточной цитометрии показал успешную сортировку миелоидных клеток и специфическую идентификацию микроглии.
- Проводилась окраска клеток живого и мертвого для оценки жизнеспособности клеток и подтверждения успешной сортировки.
- Метод позволяет получить более полное понимание реакций микроглии в демиелинизирующеих состояниях.
Выводы
- Это исследование демонстрирует эффективный метод изоляции микроглии, способствующий будущим исследованиям их роли в неврологических заболеваниях.
- Техника изоляции способствует продвижению знаний о поведении микроглии in vivo, делая ее применимой для различных моделей заболеваний.
- Этот протокол может улучшить исследования, направленные на терапевтические вмешательства, нацеленные на функцию микроглии в нейродегенеративных заболеваниях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary microglia from demyelinated mouse brain tissue enables precise investigation of innate immune responses in disease-relevant CNS models. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neuroinflammatory and demyelinating disease pipelines. High-purity microglial preparations facilitate translational continuity from discovery through preclinical research in neuroimmunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial activation states and phenotypic heterogeneity in disease-relevant CNS tissue.
- Supports functional target validation by preserving molecular characteristics of microglia from pathological lesions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory targets by isolating primary cells from in vivo models.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for downstream functional assays and compound screening.
- Improves assay reproducibility and standardization by delivering high-purity, viable cell populations.
- Enables quantitative flow cytometry readouts for cell identity and viability, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in demyelinating conditions.
- Maintains continuity from in vivo discovery to preclinical validation by preserving microglial molecular profiles.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling direct study of microglial responses in pathological CNS environments.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuroinflammatory and demyelinating disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and heterogeneity in CNS lesions.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity microglia for functional and phenotypic assays.
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry analysis of cell identity, viability, and population shifts.
- Translational Research: Preserves disease-relevant molecular features for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for isolating primary CNS immune cells across models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines cell isolation with lower equipment and expertise requirements.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by enabling direct study of primary microglia from disease models.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk and supports risk-adjusted prioritization in neuroinflammation pipelines.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microdissection and handling of CNS tissue under a stereomicroscope.
- Needs access to magnetic-activated cell sorting instrumentation and flow cytometry for validation.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different CNS regions or disease models to maintain cell purity and viability.
- Careful lesion identification and sample handling are critical to preserve molecular characteristics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
