Обнаружение и захват инвазивных клеточных субпопуляций из кокультур в режиме реального времени

Этот метод позволяет идентифицировать клетки с различными инвазивными возможностями под воздействием секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных клеток. Методика оценивает влияние секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных или иммунных клеток на клеточную инвазию. Это также позволяет восстанавливать и анализировать инвазивные клеточные субпопуляции, присутствующие в гетерогенных клеточных смесях.

Метод может определить, какие опухоли содержат инвазивные клеточные субпопуляции, которые приводят к метастазированию. Захват и анализ инвазивных раковых клеток может информировать о решениях о терапии. Чтобы начать клеточную культуру, промывайте клеточные культуры, имеющие примерно 70% слияние с 1X фосфатным буферным физиологическим раствором.

Затем добавляют 0,05% трипсина и раствор ЭДТА для удаления клеток. Нейтрализуют раствор трипсина клеточными культуральными средами, содержащими сыворотку, и подсчитывают клетки с помощью аликвоты клеточной суспензии. Поместите все три стерильные камеры в вытяжку для культивирования тканей.

Расположите ручку на короткой стороне нижней камеры и сориентируйте нижнюю камеру так, чтобы ручка была обращена к экспериментатору. Добавьте от 30 000 до 50 000 клеток в 90 микролитров среды в каждую лунку из нижней камеры без образования пузырьков. Используйте 5% добавляемых среды с сывороткой крупного рогатого скота плода в двух нижних камерах в качестве положительного контроля подвижности клеток и используйте 0% сывороточных добавляемых сред в качестве отрицательного контроля.

Поверните нижнюю камеру на 90 градусов, дав ей отстояться в течение 10-15 минут в капоте. Затем поместите среднюю камеру сверху так, чтобы ручка на нижней камере скользила в выемку на средней камере. Толкайте камеру вертикально вниз, пока не раздастся щелчок с каждой из длинных сторон узла.

Добавьте 160 микролитров бессывороточной среды во все лунки средней камеры. Убедитесь, что куполообразный мениск виден после заполнения колодцев, и поместите верхнюю камеру с электродами, обращенными вниз к средней камере, чтобы выровнять синие точки на средней и верхней камерах. Толкайте камеру вертикально вниз, пока с каждой из длинных сторон узла не раздастся звук щелчка.

Добавьте от 20 до 50 микролитров среды без сыворотки в верхнюю камеру. Установите сборку на анализатор клеток двойного назначения в инкубаторе культуры тканей и подождите 30 минут, прежде чем измерять фон. Откройте программное обеспечение анализатора ячеек, затем выберите подставку для использования, а затем нажмите на вкладку сообщения и убедитесь, что на ней написано «Соединения в порядке», чтобы убедиться, что массив хорошо расположен в подставке, а электроды хорошо выровнены с датчиками.

Перейдите на вкладку «Заметки об эксперименте» и заполните всю возможную информацию об эксперименте. Затем нажмите на вкладку макета и заполните описание макета массива. Затем нажмите на вкладку расписания и добавьте два шага из меню шагов, фоновый шаг с одной разверткой и шаг теста со 100 развертками.

После того, как массив находился в инкубаторе клеточного анализатора двойного назначения в течение 30 минут, нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать фоновое измерение. После того, как фоновое измерение будет сделано, извлеките массив из колыбели и поместите его обратно в вытяжку для культивирования клеток. Затем добавьте от 30 000 до 50 000 клеток в 100 микролитрах свободной от сыворотки среды к каждой лунке верхней камеры.

Это клетки, которые электрод обнаружит, как только они успешно мигрируют через мембрану. Дайте сборке постоять в капоте в течение 30 минут перед установкой на анализатор ячеек двойного назначения для измерения импеданса. Поместите массив обратно в анализатор ячеек двойного назначения и проверьте вкладку сообщения Подключение в порядке".

Нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать измерение импеданса, а затем нажмите на вкладку графика, чтобы отслеживать ход сигнала. Если конечная точка достигнута до 25 часов, щелкните шаг прерывания в раскрывающемся меню выполнения. Чтобы экспортировать данные, щелкните диаграмму правой кнопкой мыши, выберите «Копировать» в формате списка, а затем вставьте данные в электронную таблицу.

Отслеживайте скорость миграции в режиме реального времени на анализаторе ячеек двойного назначения, чтобы определить интересующую точку остановки. После этого отсоедините узел от анализатора клеток двойного назначения и поместите его в вытяжку для культивирования тканей. Подготовьте соответствующее количество 1,5 миллилитров микроцентрифужных трубок для сбора клеток из интересующих лунок.

Поместите узел в 10-сантиметровую посуду, чтобы она содержала жидкости, когда камеры отсоединяются. Отодвигайте гибкие защелкивающиеся концы на длинной стороне средней камеры внутрь, пока не раздастся звук щелчка, после чего разберите верхнюю камеру и переверните ее в новую 10-сантиметровую тарелку. Используйте подъемник клеток с 13-миллиметровым лезвием, чтобы собрать клетки из всех скважин, имеющих одинаковое экспериментальное состояние.

Промыть или окунуть лезвие в 1X фосфатный буферизованный физиологический раствор, чтобы собрать клетки в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки. Затем вращайте клетки в 500 раз G в течение пяти минут и распространяйте эти собранные клетки или выполняйте анализ конечных точек, такой как секвенирование одноклеточной РНК. Оценка инвазии клеток при наличии или отсутствии стромальных клеток показала, что клеточная инвазия MDA-MB-231 усиливалась, когда облученные swiss-3T3 фибробласты штамма J2 сидели в нижней камере для обмена факторами между двумя клеточными линиями.

Интересно, что инвазия MDA-MB-231 увеличилась, когда число ячеек 3T3 J2 удвоилось. С другой стороны, скорость инвазии инвазивного клона клеток MCFDCIS, DCIS-Delta Four, по-видимому, ингибируется перекрестными помехами с клетками 3T3 J2, что предполагает ценное применение трехкамерного массива для измерения различных эффектов стромы. В этом случае фибробласты на клеточную инвазию.

Эндотелиальные клетки пупочных вен человека были более инвазивными в ответ на факторы, секретируемые клетками MDA-MB-231, в отличие от тех, которые секретируются клетками DCIS, что согласуется со способностью инвазивных опухолей рекрутировать эндотелиальные клетки для формирования кровеносных сосудов и последующей диссеминации в кровообращение. Инвазия клеток ксенотрансплантата пациента из верхней камеры увеличивалась в ответ на совместно культивируемые иммунные клетки костного мозга человека. Интересно, что наличие 2% сыворотки в нижней камере с иммунными клетками костного мозга человека было необходимо для инвазии ксенотрансплантатов, полученных пациентом.

Колодцы могут быть покрыты внеклеточным матриксом, чтобы имитировать барьер базальной мембраны. Лечебные средства могут быть добавлены в среды в колодцах для мониторинга их влияния на инвазию.