Микродиссекция слоев трехстворчатых клапанных листовок для двухосной механической характеристики и микроструктурной количественной оценки

Этот метод может изолировать вклад тканевых слоев в общее поведение тканей, обеспечивая новое понимание микроструктуры ткани. Наша система микродиссекции и тестирования позволяет нам напрямую сравнивать механические и микроструктурные свойства створок сердечного клапана с их собственными композитными слоями. Микродиссекция может быть трудно освоить, поэтому настоятельно рекомендуется практиковаться как можно больше перед началом исследования.

Во-первых, соберите необходимые материалы, восковую доску, воду DI, пипетку, скальпель, микроножницы, тонкие щипцы, изогнутые щипцы, толстые щипцы и штифты. Отсоедините ткань от двухосного тестера и измерьте ее толщину с помощью лазерного датчика смещения. Поместите ткань на восковую доску.

Исследуйте желудочковую сторону ткани на предмет больших введений хорды. Сделайте фотографию для справки. Выложите ткань плоско на восковую доску атриалисом вверх.

Чтобы прикрепить ткань к доске, поместите один штифт под углом от ткани в каждом углу так, чтобы он слегка притягивал ткань подтянутой. Убедитесь, что штифты находятся вне отверстий, создаваемых зубцами при монтаже ткани, а ткань квадратная и не смещается во время микродиссекции слоя. При необходимости поместите штифты вдоль боковой стороны ткани во время рассечения, чтобы растянуть ткань больше.

Снимите стеклянные шариковые фидуциальные маркеры. Поместите воду DI на поверхность ткани пипеткой так, чтобы она полностью покрывала ткань пузырьковым способом. Чтобы сделать начальный угол, выделите угол закрепленного экземпляра, избегая больших вставок хорды в хрупких областях.

Затем разрезайте слой A/S, слегка перетащив скальпель по поверхности ткани вдоль монтажных отверстий для механических испытаний. Края разреза начинают раздвигаться, открывая слой F / V внизу. Тупыми, тонкими щипцами плотно протереть вдоль разреза, чтобы еще больше отделить его края.

Если разрез в слое A/S не начинает раздвигаться, слегка проведите по тому же срезу снова скальпелем. Сделайте второй разрез перпендикулярно первому срезу. Если два разреза не соединены, проведите тонкий пинцет под небольшой участок ткани, разделяющий два разреза.

Затем осторожно используйте ножницы, чтобы разрезать ткань. Протрите вдоль разрезов угла тонкими щипцами до тех пор, пока ткань не отделится от F/V слоя. Как только небольшой кусочек ткани отделяется, схватите его большим пинцетом и осторожно потяните его, чтобы разделить композитные слои дальше.

Продолжайте отслаивать ткань, захватывая ее большим пинцетом, чтобы предотвратить нежелательное разрыв и разрыв композитного слоя A/S, и растирайте шов до тех пор, пока он не достигнет конца двух разрезов, сделанных для угла. Если в первом углу есть серьезные проблемы с разделением, попробуйте другой угол в качестве отправной точки. Затем, чтобы сделать второй угол, удлините два разреза, сделанных для первого угла, поместив кончик скальпеля в нижней части каждого разреза и слегка потащив его по поверхности ткани, чтобы удлинители разреза соединились с исходными разрезами и продолжали следовать за отверстиями для швов или швов.

Продолжайте расширять разрезы и отслаивать верхний композитный слой A/S обратно, протирая шов до тех пор, пока одна сторона не будет закончена. Обратите внимание, что ткань будет полностью разделена вдоль одного разреза. Далее создайте второй угол перпендикулярно концу полностью отслоившейся стороны.

Вытяните оставшиеся разрезы, избегая больших вставок хорды. Исключить вставки хорды из зоны разделения A/S только тогда, когда это исключение позволит получить образец A/S, достаточно большой для экспериментальных характеристик. Продолжайте разделять слои A/ S и F / V, используя методы трения и вытягивания, используемые для первого угла.

Немедленно прекратите отделять ткань, если образуется разрыв или отверстие. Чтобы предотвратить попадание пинцета, поместите ножницы в любое отверстие, которое образуется, и отрежьте ткань от центра. Если дефект образуется по шву разделения, то начинают отделять ткань по другому краю.

Ищите межслойные соединения, которые могут появиться при разделении ткани и предотвратить дальнейшее разделение тканей. Обратите внимание, что это тонкие, но прочные пряди, которые необходимо аккуратно разрезать ножницами. Избегайте создания отверстия в слое A/S или вырезания вниз слоя F/V.

Продолжайте этот процесс до тех пор, пока не будет отделен как можно больший возможный образец слоя A/S. Отметьте ориентацию образца с помощью хирургической ручки. Наконец, вырежьте ножницами вдоль шва отделение для оставшегося края ткани.

Поместите отдельный композитный слой A/S ровно на режущий мат. При необходимости используйте скальпель для выпрямления краев ткани и создания квадратной формы ткани, подходящей для двухосного механического испытания. Поместите слой A/S в воду DI до тех пор, пока он не будет готов к тестированию.

Отметьте ориентацию слоя F/V, оставшегося на восковой доске. Вырежьте максимально возможный квадрат из области, где был удален слой A/S. Затем поместите его в воду DI.

Гистологический анализ неповрежденного листочка и двух рассеченных слоев проверил, правильно ли ткань была разделена вдоль границы между губчатой и фиброзой. Гистологические микроснимки были использованы для определения толщины слоя ткани и составляющих массовых фракций с использованием программного обеспечения ImageJ. Контролируемое смещение механических испытаний и последующей обработки приводило к отображению натяжения мембраны по сравнению с данными растяжения переднего листа трикуспидального клапана, заднего листа трикуспидального клапана и листа перегородки трикуспидального клапана, описывая нелинейное механическое поведение ткани.

Поляризованные данные пространственной частотной области визуализации дали цветные карты ориентации коллагенового волокна и степени оптической анизотропии. В частности, эти цветовые карты обеспечили всестороннее понимание архитектуры коллагенового волокна во всем образце ткани. Важно отметить, что композитный слой сжимается, как только они отделяются от закрепленной ткани.

Соберите максимально возможный образец, чтобы убедиться, что ткани достаточно для последующего тестирования.