Амплификация кишечной палочки в микрофлюидном чипе непрерывной ПЦР и ее детектирование с помощью системы капиллярного электрофореза

В этом протоколе описывается, как построить систему непрерывной полимеразной цепи на основе микрофлюидного чипа и как построить систему капиллярного электрофореза в лаборатории. Он представляет собой простой способ анализа нуклеиновых кислот в лаборатории. Полимеразная цепная реакция является традиционным методом, используемым для амплификации гена-мишени.

Тем не менее, традиционная ПЦР занимает очень много времени из-за эффективности низкотемпературных вариаций. В данной работе предложена система непрерывной ПЦР на основе микрофлюидного чипа. Время амплификации можно значительно сократить, запустив раствор ПЦР в микроканал, размещенный на нагревателях, настроенных на различные температуры.

Поскольку CE обладает многими преимуществами, такими как высокое разрешение, высокая скорость и отличная воспроизводимость, он стал популярным инструментом в лаборатории для анализа нуклеиновых кислот и белков. Однако большинство лабораторий, особенно в развивающихся странах, не могут позволить себе эту технологию из-за высокой цены прибора CE. В этой статье мы описали протоколы изготовления микрофлюидного чипа CF-PCR и создания универсальной системы CE в лаборатории.

Мы также демонстрируем процесс амплификации Escherichia coli с помощью системы CF-PCR и детектирования продуктов ПЦР с помощью системы CE. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, пользователи должны иметь возможность изготавливать микрофлюидные чипы, готовить ПЦР-раствор, создавать систему CF-PCR для амплификации нуклеиновых кислот и настраивать простую систему CE даже с ограниченными ресурсами для разделения фрагментов ДНК. Нагрейте кремниевую пластину при температуре 200 градусов Цельсия в течение 25 минут, чтобы удалить влагу.

Дозируйте один миллилитр фоторезиста SU-8 2075 на дюйм пластины. Вращайте его на кремниевой пластине с помощью машины для нанесения покрытий при 500 об/мин в течение 5-10 секунд с ускорением 100 об/мин, а затем при 2 000 об/мин в течение 30 секунд с ускорением 500 об/мин. Выпекайте его при температуре 65 градусов по Цельсию в течение трех минут и при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 15 минут.

Установите от 150 до 215 миллиджоулей на квадратный сантиметр в качестве энергии экспозиции для фотолитографического аппарата и выгравируйте разработанный узор на фоторезисте с помощью фотолитографической маски. Поместите кремниевую пластину и маску, готовые к экспонированию. После выдержки выпекайте при температуре 65 градусов по Цельсию в течение двух минут и при температуре 95 градусов по Цельсию в течение семи минут.

Погрузите кремниевую пластину в раствор проявителя, чтобы удалить излишки фоторезиста, и выньте ее, когда будут видны микроканалы. Затем используйте изопропанол, чтобы смыть остатки раствора проявителя. Смешайте преполимер полидиметилсилоксана и отвердитель в соотношении 10 к 1.

Вылейте смешанный раствор PDMS в форму для реплики и затвердейте при температуре 80 градусов Цельсия в течение 60 минут. Приклейте микрофлюидный чип PDMS к предметному стеклу после активации с помощью плазменного очистителя и как можно скорее затвердейте при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Используйте вихревой смеситель и центрифугу, чтобы убедиться, что реагенты хорошо перемешаны.

Подготовьте центрифужную пробирку. Сначала добавьте воду в центрифужную пробирку. Затем добавьте матрицу ДНК, праймер, буфер, смесь dNTP, Tween 20, PVP и, наконец, добавьте ДНК-полимеразу.

Наконец, перемешайте раствор вихрем. Подготовьте два керамических нагревателя PTC, два твердотельных реле, два регулятора температуры, два датчика температуры и шнур питания. Подключите нагреватель к твердотельному реле.

Подключите твердотельное реле к ПИД-регулятору температуры. Затем прикрепите щуп датчика температуры к нижней части двух нагревателей и подсоедините клемму к ПИД-регулятору температуры. Наконец, соедините два твердотельных реле последовательно и подключите шнур питания.

Напечатайте на 3D-принтере прорезь для двух нагревателей и держите нагреватели в одной плоскости. Поместите микрофлюидный чип на два нагревателя. Подготовьте шприцевой насос и шприц, затем зафиксируйте шприц на шприцевом насосе.

Соедините силиконовую трубку со шприцем и подсоедините стальную иглу к верхней части силиконовой трубки. Вставьте стальную иглу во входное отверстие микрофлюидной стружки. Поместите наконечник пипетки на выходе чипа для сбора продуктов ПЦР.

Используйте высоковольтный источник питания для создания электрического поля импульсного поля. Смотрите, это высоковольтный источник питания. Это положительные и отрицательные электроды.

Используйте ртутную лампу в качестве источника света и отфильтруйте длину волны возбуждения от ртутной лампы через фильтр. Поместите капилляр на предметный столик микроскопа. Соберите флуоресцентное излучение с помощью объектива, а затем детектируйте его с помощью фотоумножителя.

Это наш микроскоп, а это наш капилляр. Теперь включаем свет в условиях темного помещения. Возбуждающий свет собирается объективом.

Используйте программное обеспечение LABVIEW собственной разработки для управления источником питания и завершения сбора данных. Предварительно установите температуру нагревателей системы CF-PCR на уровне 65 градусов по Цельсию и 95 градусов по Цельсию. Поместите микрофлюидный чип на два нагревательных блока.

Вставьте кончик силиконовой пробирки в центрифужную пробирку, содержащую 50 микролитров раствора ПЦР. Потяните за поршень шприца, чтобы медленно извлечь раствор. Зафиксируйте шприц на шприцевом насосе.

Вставьте стальную иглу во входное отверстие микрофлюидной стружки. Установите расход насоса на 10 микролитров в минуту и нажмите кнопку запуска, чтобы протолкнуть раствор в микроканале на входе микрочипа. Соберите продукты ПЦР на выходе из микрофлюидного чипа.

Подготовьте капилляр общей длиной 8 сантиметров и эффективной длиной 6 сантиметров. Приготовьте буфер для разделения, смешав 100 микролитров 1%-ного HEC, два микролитра 100-кратного SYBR Green и 98 микролитров сверхчистой воды, чтобы получить 0,5%-ный HEC, содержащий 1x SYBR Green. Заполните капилляр подготовленным разделительным буфером с помощью вакуумного насоса.

Введите напряжение впрыска и время впрыска в программном интерфейсе, нажмите кнопку запуска и подождите, пока продукты ПЦР будут электродинамически введены в капилляр. Введите напряжение постоянного тока в программном интерфейсе, нажмите кнопку «Пуск» и запустите электрофорез при напряженности электрического поля 100 вольт на сантиметр. Нажмите кнопку «стоп» после того, как все фрагменты ДНК будут разделены в капилляре.

Промывайте капилляр стерилизованной водой в течение одной минуты после каждого запуска. На этом снимке представлена электроферограмма продуктов ПЦР и ДНК-маркеров. Сначала мы амплифицировали ген-мишень Escherichia coli в системе CF-PCR, и раствор ПЦР занял около 10 минут и 30 секунд от входа до выхода чипа.

Размер ампликона-мишени Escherichia coli составил 544.н. После этого мы проанализировали продукты амплифицированной ПЦР в системе капиллярного электрофореза. Кроме того, в тех же экспериментальных условиях был проведен капиллярный электрофорез 100.н. ДНК-лестницы.

Размер ПЦР-продукта можно оценить по электроферограмме ДНК-лестницы. Каждый эксперимент проводился трижды для воспроизводимости. Данные на этом рисунке показывают, что пик, соответствующий продуктам ПЦР Escherichia coli, наблюдался после разделения, а время миграции продуктов ПЦР в микрофлюидном чипе соответствовало таковому в термоамплификаторе.

И ПЦР, и КЭ являются двумя популярными биотехнологиями в анализе нуклеиновых кислот. В данной статье описывается амплификация кишечной палочки и выявление продуктов ПЦР с помощью систем CF-PCR и CE, разработанных собственными силами. Ген-мишень Escherichia coli был успешно амплифицирован в течение 10 минут, а фрагменты ДНК размером менее 1500.н. были разделены в течение восьми минут.

Кроме того, система CF-PCR на основе микрофлюидного чипа и система CE, представленная в этой работе, просты в изготовлении и могут предложить простой способ анализа нуклеиновых кислот в лаборатории. Он может усиливать и детектировать только один образец за раз, что ограничивает его широкое применение. Таким образом, разработка интегрированной микрофлюидной матрицы CF-PCR и CE для высокопроизводительного обнаружения патогенов все еще находится на пути.