Субконъюнктивальное введение аденоассоциированных вирусных векторов в моделях мелких животных
16 марта 2022 г.
В этой рукописи субконъюнктивальная инъекция демонстрируется как действительный векторный метод доставки для глазных тканей у мышей с использованием системы инъекций, состоящей из инфузионно-выводного шприцевого насоса и газонепроницаемого съемного шприца в сочетании с микроинъекционными иглами. Эта система инъекций также адаптируется для других внутриглазных путей введения.
Этот протокол предлагает метод доставки генной терапии к нескольким глазным тканям безопасным, простым и эффективным способом. Он также адаптируется для интрастромальных и субретинальных инъекций у мелких животных. Использование субконъюнктивального пути инъекции является минимально инвазивным.
Это создает меньше рисков и имеет большие перспективы для доставки AV для лечения нескольких глазных заболеваний. Поскольку более 1 миллиарда человек во всем мире страдают от нарушений зрения, использование безопасного и простого метода доставки лекарств обеспечивает широкое применение для лечения многих различных причин слепоты. Методы доставки генов, описанные в этом протоколе, представляют особый интерес для тех, кто разрабатывает потенциальные стратегии вмешательства и практикующих офтальмологов, которые в конечном итоге доставят эти препараты пациентам.
Самой большой проблемой для тех, кто выполняет этот протокол впервые, вероятно, является введение иглы в понятие конъюнктивального пространства. Для начала соберите систему впрыска, поместив стереомикроскоп и шприцевой насос в шкаф биобезопасности. Далее разрезаем полиэтиленовую трубку на длину примерно 50 сантиметров.
Вставьте конец иглы 36-го калибра в один конец трубки. Затем наполните одноразовый 3-миллилитровый шприц стерильной водой и вставьте его в сторону трубки напротив иглы. Промывайте трубку три раза, чередуя стерильную воду и 70% спирт, чтобы дезинфицировать трубку и убедиться, что нет утечек, засоров или повреждений по всей трубке.
Используя одноразовый 3-миллилитровый шприц, наполните трубку стерильной водой и оставьте трубку прикрепленной к одноразовому шприцу. Затем поместите кусок пенопласта на поверхность шкафа биобезопасности и добавьте в него бассейн со стерильной водой. Погрузите часть трубки, подключенную к игле, в бассейн со стерильной водой.
Затем вытащите одноразовый шприц из отверстия трубки, чтобы предотвратить попадание воздуха в систему трубок после извлечения шприца. Затем наполните 10-микролитровый шприц Гамильтона стерильной водой. Затем подключите иглу шприца Гамильтона к открытому концу трубки, погружая кончик иглы шприца Гамильтона в бассейн со стерильной водой на парапленке.
Нажмите и удерживайте быструю кнопку заднего хода на экране насоса, чтобы переместить толкающие блоки на приблизительную длину шприца. Затем открутите зажимные ручки кронштейна, чтобы ослабить стопорные кронштейны на толкателе и блоках держателя шприца. Затем загрузите шприц Hamilton на блок держателя шприца и закрепите шприц в соответствии с инструкциями производителя.
Чтобы настроить параметры на экране настроек насоса, нажмите кнопку «Усилие» и установите уровень силы на уровне 30%Затем примите изменения, чтобы вернуться на экран настроек. Нажмите кнопку «Быстрый запуск», выберите «Метод», а затем выберите параметр «Только вливать». Для варианта шприца выберите Hamilton 1700, затем нажмите «Стекло» и выберите 10 микролитров.
Затем выберите скорость инфузии и объем инъекции. Извлеките воду из шприца Гамильтона, оставив трубку и инъекционную иглу, наполненную водой, нажав кнопку Infuse". Затем выведите вирус, поместив инъекционную иглу в аликвоту запаса вируса.
Затем слегка потяните назад шприц Гамильтона, нажав кнопку обратного хода, чтобы ввести небольшой пузырь воздуха в трубку. После обезболивания животного захватите конъюнктиву щипцами. Затем вставьте иглу в конъюнктиву до тех пор, пока скос не будет полностью покрыт мембраной конъюнктивы, и положите иглу на глобус.
Одновременно запустите инъекцию, нажав кнопку Пуск с помощью ножного переключателя. Для изучения распределения вектора AAV глазные и окружающие ткани окрашивали гематоксилином и эозином. Репрезентативные сагиттальные срезы показали, что рассеивание индийских чернил происходило в основном рядом с экстраокулярными мышцами на внешней поверхности склеры в периокулярных рыхлых соединительных тканях.
Чтобы подтвердить трансдукцию самокомплектного AAV 8 через восемь недель после инъекции, обилие белка зеленой флуоресценции в поперечных сечениях исследовали иммунофлуоресцентным окрашиванием. Результаты показали, что векторы AAV 8 эффективно трансдуцировали периокулярные мышцы сзади от глаза и роговицы. Чтобы проанализировать векторное биораспределение, номера копий векторного генома и отдельные глазные компартменты в других органах, включая печень и сердце, были исследованы количественной полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров и зондов, специфичных для трансгена.
Экспрессия трансгена была подтверждена количественной полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией, которая предполагала, что субконъюнктивальная инъекция AAV 8 приводит к экспрессии трансгена в веке, конъюнктиве, роговице и зрительном нерве. Воздушный пузырь будет служить барьером между водой в трубке и лечебным препаратом. Этот метод позволяет другим исследователям исследовать использование субконъюнктивального пути введения как для офтальмологических растворов, так и для глазной генной терапии для множественных заболеваний.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод доставки препаратов для генной терапии в различные ткани глаза, который является безопасным, простым и эффективным. Субконъюнктивальный путь введения минимально инвазивен и сопряжен с меньшими рисками, что делает его весьма перспективным для доставки аденоассоциированных вирусов (AV) при лечении различных заболеваний глаз.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная терапия
- Методы доставки в глаза
- Малоинвазивные методы
Теоретические сведения
- Более 1 миллиарда человек во всем мире страдают от нарушений зрения.
- Безопасные и простые методы доставки лекарственных средств имеют решающее значение для лечения слепоты.
- Данный протокол может быть адаптирован для интрастромальных и субретинальных инъекций у мелких животных.
- Разработка стратегий терапевтического вмешательства при глазных заболеваниях представляет большой интерес.
Цель исследования
- Продемонстрировать эффективный метод доставки вектора в ткани глаза.
- Предложить малоинвазивный вариант проведения генной терапии.
- Повысить безопасность и эффективность доставки лекарственных препаратов в ткани глаза.
Используемые методы
- Субконъюнктивальная инъекция с использованием шприцевого насоса для инфузии/отбора.
- Использование герметичного съемного шприца в сочетании с иглами для микроинъекций.
- Адаптация системы инъекций для различных путей внутриглазного введения.
- Оценка методов доставки на моделях мелких животных.
Основные результаты
- Метод субконъюнктивальных инъекций эффективен для генной терапии глаз.
- Минимальная инвазивность снижает риски, связанные с инъекциями в область глаза.
- Метод демонстрирует широкую применимость для лечения множества глазных заболеваний.
- Потенциал значительного влияния на лечение нарушений зрения.
Выводы
- Субконъюнктивальная инъекция является перспективным методом доставки лекарственных средств в глаза.
- Этот метод представляет собой безопасный и эффективный подход к проведению генной терапии.
- Данный протокол может помочь офтальмологам в проведении лечения пациентов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Субконъюнктивальное введение векторов на основе аденоассоциированного вируса (AAV) на моделях мелких животных позволяет решить проблему безопасной локальной доставки генов при лечении глазных заболеваний. Этот малоинвазивный метод обеспечивает точное воздействие на ткани глаза, что повышает прогностическую достоверность исследований генной терапии на ранних стадиях. Его адаптивность и воспроизводимость делают его ценным инструментом для отбора перспективных кандидатов и обеспечения трансляционной непрерывности при разработке офтальмологических лекарственных препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Позволяет проверять гипотезы о доставке генов в ткани глаза с минимальной инвазивностью.
- Способствует снижению биологических рисков за счет обеспечения таргетной трансдукции и анализа тканеспецифической экспрессии.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе вектора и пути введения для программ генной терапии заболеваний глаз.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных моделей на мелких животных для последующего анализа экспрессии генов и таргетного воздействия на ткани.
- Стандартизация параметров инъекции для обеспечения воспроизводимости и количественной оценки распределения вектора.
- Возможность надежного сравнения серотипов AAV и путей введения для оценки готовности к скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям заболеваний глаз для оценки экспрессии трансляционных биомаркеров после доставки.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации путем подтверждения тканеспецифичной экспрессии трансгена.
- Предоставляет данные с учетом рисков для принятия решений о продвижении проектов по генной терапии глаз в разработке.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс перехода от этапа открытия к доклиническим исследованиям, обеспечивая возможность проверки гипотез, оптимизации векторов и количественной валидации на моделях глаз мелких животных.
- Открывающая биология: способствует уточнению сигнальных путей и снижению биологических рисков посредством направленной доставки генов и анализа экспрессии.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для сравнения эффективности векторов и путей введения.
- Аналитика: предоставляет данные измерений методом иммунофлуоресценции и qPCR для оценки тканеспецифической экспрессии трансгена и биораспределения.
- Трансляционные исследования: связывает этап раннего поиска с доклинической валидацией путем подтверждения доставки и экспрессии в тканях, имеющих значение для патологии.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированную, адаптируемую платформу для проведения многочисленных исследований по офтальмологической генной терапии и доставке лекарственных средств.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и уменьшает неопределенность механизмов в исследованиях генной терапии органов зрения.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость протоколов доставки препаратов в глаза.
- Стратегическая ценность: оптимизирует процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет получения надежных данных на ранних этапах.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию и продвижение кандидатов для генной терапии органов зрения с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения офтальмологических процедур на мелких животных и владение методами микроинъекций.
- Необходим доступ к программируемым шприцевым насосам, операционным микроскопам и аналитическим инструментам для валидации.
- Требуется стандартизация параметров инъекций и методов валидации между исследовательскими группами.
- Методика применима для различных путей внутриглазного введения и офтальмологических растворов.
- Практические ограничения включают требования к техническим навыкам и анатомические особенности конкретных моделей.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:26
Preparation and Administration of Adeno-Associated Virus via Subconjunctival Injection
4:21
Results: Analysis of AAV Vector Administration, Biodistribution and Transgene Expression into the Subconjunctival Space
5:41
Conclusion
