Оценка надежного биомаркера в мышиной модели сепсиса, вызванной перевязкой и пункцией,
9 декабря 2022 г.
Этот протокол представляет оперативные детали перевязки и пункции слепой кишки (CLP) в мышиной модели сепсиса. CLP является одним из наиболее широко используемых методов для создания животной модели сепсиса. Поэтому для достижения надежных результатов исследований требуется стандартизированный протокол CLP.
Основной целью данного исследования является использование мышиной модели перевязки слепой кишки и пункционно-индуцированного сепсиса для оценки надежного биомаркера сепсиса в крови. Перевязка и пункция слепой кишки, или сокращенно CLP, является клинически значимой моделью сепсиса. CLP является широко используемой моделью в исследованиях сепсиса.
Цитруллинированный гистон H3, или CitH3, происходит от НЕТоза, вызванного сепсисом. Наше предыдущее исследование показывает, что CitH3 является надежным диагностическим биомаркером сепсиса. Выберите самцов мышей C57BL/6.
Взвешивают мышь, и обезболивают мышь путем вдыхания 1,5% изофлурана. Закрепите мышь на грелке. Нанесите крем для депиляции на живот и оставьте не дольше одной минуты перед удалением крема и волос.
Подготовьте стерильные хирургические инструменты, подходящие для хирургии грызунов на животных. Дезинфицируйте кожу живота йодом не менее трех раз. Накройте оперативную хирургическую область соответствующей стерильной хирургической драпировкой.
Используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы сделать примерно двухсантиметровый разрез в брюшной стенке, вдоль linea alba. Определите и выделите слепую кишку из брюшинной полости стерильным пинцетом. Лигат 75 объема слепой кишки с 4-0 шелковым швом.
Не следует лишать брыжеечные кровеносные сосуды. Следует отметить, что различный процент перевязанной слепой кишки определяет тяжесть сепсиса. 25% приводит к низкосортному сепсису, 50% приводит к сепсису средней степени, а 75% приводит к полноценному сепсису.
Проколите слепую кишку одной сквозной перфорацией иглой 21 калибра в средней точке между хвостовым концом и перевязкой. Аккуратно выдавите кал из слепой кишки через отверстия для проникновения. Следует отметить, что количество каловых масс, втиснутых в брюшинную полость, должно быть постоянным, так как кал также определяет выраженность сепсиса.
Осторожно замените слепую кишку, а также кал в брюшную полость. Закройте мышечный слой живота и слой кожи 6-0 шелковым швом. Продезинфицируйте разрез йодом.
Инъекция кетопрофена, пять миллиграммов на килограмм, должна быть выполнена в нижний левый квадрант живота, чтобы избежать слепой кишки. Поместите мышь на грелку до полного восстановления. Мышь размещается в помещении с контролируемой температурой и получает свободный доступ к пище и воде.
Животные будут усыплены передозировкой углекислого газа с симптомами сепсиса, имеющими отношение к нашим предопределенным конечным точкам, основанным на представленном нами исследовании. Мыши случайным образом делятся на фиктивную группу, группу CLP и группу лечения CLP плюс Cl-амидин или YW3-56. Мыши в фиктивной группе получают все процедуры CLP, кроме перевязки слепой кишки и пункции.
Соберите периферическую кровь через 24 часа после операции и подготовьте сыворотку путем центрифугирования. Концентрацию CitH3 определяли с помощью вестерн-блоттинга и самостоятельно разработанного набора ИФА. Как показано на рисунке два, в фиктивной группе не было обнаружено CitH3.
Уровни CitH3 были повышены после введения CLP, что значительно ослаблялось ингибированием PAD. Основываясь на наших данных, мы делаем вывод, что циркулирующий CitH3 является надежным диагностическим биомаркером сепсиса.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлены операционные детали процедуры лигирования и пункции слепой кишки (CLP) на мышиной модели сепсиса. CLP является одним из наиболее широко используемых методов создания животной модели сепсиса, что обуславливает необходимость применения стандартизированного протокола для получения надежных результатов исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Исследование сепсиса
Теоретические основы
- Лигирование и пункция слепой кишки (CLP) представляют собой клинически значимую модель сепсиса.
- Модель CLP широко применяется в исследованиях сепсиса.
- Надежные биомаркеры имеют важное значение для диагностики сепсиса.
- Цитруллинированный гистон H3 (CitH3) связан с вызванным сепсисом процессом NETosis.
Цель исследования
- Оценка надежных биомаркеров сепсиса в крови с использованием мышиной модели.
- Разработка стандартизированного протокола CLP для обеспечения воспроизводимости исследований.
- Изучение диагностического потенциала CitH3 при сепсисе.
Используемые методы
- Отбор самцов мышей линии C57BL/6 для исследования.
- Индукция сепсиса посредством лигирования и пункции слепой кишки.
- Оценка биомаркеров крови после индукции.
- Сравнение уровней CitH3 для оценки диагностической надежности.
Основные результаты
- Демонстрация CitH3 как надежного диагностического биомаркера.
- Стандартизированный протокол CLP, обеспечивающий воспроизводимые результаты.
- Идентификация индуцированного сепсисом NETosis в данной модели.
- Валидация мышиной модели для дальнейших исследований сепсиса.
Выводы
- Модель CLP эффективна для изучения сепсиса.
- CitH3 является перспективным биомаркером для диагностики сепсиса.
- Стандартизированные протоколы повышают надежность исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежные ранние биомаркеры имеют решающее значение для снижения рисков при поиске лекарств от сепсиса и обеспечения трансляционной преемственности при переходе от доклинических моделей к клиническим исследованиям. Модель мышей с индуцированным CLP в сочетании с количественным измерением CitH3 представляет собой стандартизированную платформу для валидации мишеней и изучения механизмов развития сепсиса. Данный подход повышает прогностическую точность и позволяет эффективно проводить приоритизацию портфеля препаратов на ключевых этапах разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить строгую проверку гипотез о патофизиологии сепсиса с использованием клинически релевантной модели на животных.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем количественного определения CitH3 как механистического биомаркера NETosis.
- Способствует снижению биологических рисков и приоритизации потенциальных мишеней для дальнейшей разработки.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимую систему оценки потенциальных терапевтических средств, нацеленных на механизмы сепсиса.
- Стандартизирует количественное определение биомаркеров с помощью валидированных методов ELISA и вестерн-блоттинга для CitH3.
- Позволяет проводить надежное сравнение эффектов вмешательства в различных экспериментальных группах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласовывает доклинические показатели биомаркеров с клиническими диагностическими потребностями при сепсисе.
- Обеспечивает преемственность между результатами исследований на животных моделях и стратегиями трансляции биомаркеров на человека.
- Снижает трансляционный риск за счет установления надежных, релевантных заболеванию конечных точек.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс разработки моделей и биомаркеров связывает этапы раннего поиска, идентификации соединений-лидеров и доклинической валидации в исследованиях сепсиса.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять механистические гипотезы и уточнять сигнальные пути NET-оза, индуцированного сепсисом.
- Скрининг: обеспечивает количественное определение CitH3 для разработки стандартизированных методов анализа и оценки соединений.
- Аналитика: дает воспроизводимые измерения биомаркеров для сравнения эффективности вмешательств и степени тяжести заболевания.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию доклинических данных о биомаркерах с клиническими диагностическими стратегиями.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую стандартизированную платформу для текущих исследований сепсиса и оценки терапевтических средств.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней сепсиса.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость и стандартизацию между исследовательскими группами и исследованиями.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет ранней сортировки на основе биомаркеров.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению программ по изучению сепсиса.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области хирургии животных, разработки методов анализа биомаркеров и количественного анализа.
- Необходим доступ к валидированным наборам для ИФА, инфраструктуре для вестерн-блоттинга и стандартизированному виварию.
- Требуется строгая межкомандная стандартизация переменных процедуры CLP и протоколов измерения биомаркеров.
- Адаптация к другим моделям заболеваний или видам животных может потребовать оптимизации и валидации протокола.
- Ограничения включают вариабельность модели в зависимости от хирургической техники и необходимость согласованных критериев конечных точек.
