Быстрое Генотипирование Мышь ткани с помощью Сигмы Извлечение-N-Amp тканей PCR Kit

Здравствуйте, меня зовут Линда, я работаю в лаборатории доктора Эдвина Ники в Калифорнийском университете в Ирвайне. Сегодня я покажу вам, как я использую набор Sigma Cyber Green Extracting Tissue PCR kit для быстрого генотипирования трансгенных мышей. Обычно я использую этот набор для генотипирования эмбриональных мышей при подготовке культур остро расщепленных клеток, когда мне необходимо максимально быстро определить генотип мыши.

Однако для сегодняшних целей мы будем использовать хвосты взрослых мышей, чтобы продемонстрировать работу с данным набором. Данный протокол включает быструю переваривание алкализацией и экстракцию ДНК с последующим коротким этапом нейтрализации. Затем мы используем экстрагированную ДНК в ПЦР в реальном времени, где сможем отслеживать наши ПЦР-ампликоны.

Итак, если вы готовы, приступим. Прежде всего необходимо убедиться, что нагревательный блок установлен на 95 °C, краситель Cyber Green разморожен и хранится на льду до начала использования, а остальные реагенты доводятся до комнатной температуры. В моем контейнере со льдом находятся два праймера, которые мы будем использовать для генотипирования; они были специально разработаны для нашего целевого гена и валидированы для QPCR.

У меня также есть положительный контроль для интересующего гена, отрицательный контроль и образец ткани, который я уже собрал от взрослой мыши. При сборе образцов тканей крайне важно соблюдать строжайшие меры предосторожности. Когда мы собираем эмбриональные хвосты мышей, мы всегда промываем пинцет 70% ethanol до и перед каждым забором ткани.

Сначала мы всегда промываем образцы хвостов в TBS, затем необходимо приготовить мастер-микс для подготовки ткани и экстракции ДНК для каждого хвоста: вам потребуется 100 µL раствора для экстракции и 25 µL раствора для подготовки ткани. Я использую дозатор P 200 и наконечники с фильтром, чтобы отобрать 100 µL раствора для экстракции и 25 µL раствора для подготовки ткани в новую пробирку Eppendorf. Перемешайте полученный мастер-микс, несколько раз всасывая и вытесняя жидкость с помощью дозатора.

Затем необходимо добавить 125 µL мастер-микса к образцу интересующего вас типа, убедившись, что если это хвост взрослой мыши, то срез полностью погружен в раствор мастер-микса; после чего образец можно перемешать путем осторожного встряхивания пальцами и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Во время этой 10-минутной инкубации я подготовлю свой любимый «зеленый» мастер-микс, который состоит из cider green master mix, входящего в состав набора, воды Milli-Q или воды для ПЦР, а также наших прямых и обратных праймеров. На этом всё.

После завершения 10-минутной инкубации необходимо нагреть смесь и активировать реакцию при 95 °C в течение трех минут. По прошествии трех минут инактивации следует добавить нейтрализующий раствор, входящий в состав набора: по 100 µL на одну реакцию, после чего смесь перемешивают с помощью вортекса. После добавления нейтрализующего буфера образцы ДНК можно хранить при температуре 4 °C до момента использования.

Нам необходимо получить генотип как можно скорее, поэтому мы сразу переходим к QPCR; мои образцы из хвостов нейтрализованы и готовы. Мастер-микс для ПЦР с красителем Cyber Green подготовлен, а ПЦР-пробирки размещены на охлаждающем блоке.

Теперь я просто добавлю по 16 µL мастер-микса в каждую лунку, а затем добавлю по 4 µL нейтрализованного экстракта или 4 µL положительного или отрицательного контроля в каждую. Таким образом, я добавляю по 16 µL мастер-микса в каждую лунку. Затем я добавлю 4 µL нейтрализованного экстракта к 16 µL мастер-микса в лунке, чтобы общий объем реакции составил 20 µL.

Аналогичные действия я выполню для положительного и отрицательного контролей. Добавьте 4 µL к 16 µL мастер-микса для ПЦР. После добавления всех компонентов закройте пробирки optically clear eight cap strip.

Старайтесь не касаться прозрачной части крышек, закрывающих ваши образцы. Поэтому я использую салфетку Kimwipe, чтобы прижать крышки и убедиться, что они плотно закрыты. Я осторожно перемешал смесь для ПЦР и ДНК на вортексе, отцентрифугировал их, и теперь мы готовы поместить их в прибор для количественной ПЦР.

Сначала мы загрузим образцы в ПЦР-амплификатор Opticon. Я создам новую схему расположения образцов на планшете, где первая лунка будет содержать наш образец, вторая — положительный контроль, а третья — отрицательный контроль. Укажите, что общий объем реакционной смеси составляет 20 µL. Затем я загружу протокол, разработанный для быстрого генотипирования.

Данный протокол включает этап денатурации продолжительностью три минуты, затем цикл, состоящий из 15 секунд денатурации, 15 секунд первичного отжига и 20 секунд первичной элонгации. Время первичной элонгации фактически может быть сокращено примерно до 10 секунд, в результате чего общая продолжительность цикла составит всего 40 секунд. Для каждого цикла эти три этапа повторяются около 40 раз, как при обычном ПЦР, после чего в конце проводится анализ кривой плавления.

Таким образом, планшет подготовлен, а протокол загружен. Теперь нам остается только запустить QPCR, начиная с трехминутной денатурации. Исходя из моего опыта использования данных праймеров, образцов хвостов и поиска конкретных генов, я знаю, что положительные результаты начнут появляться примерно к 25-му циклу, пересекая значимый порог цикла.

Теперь, время этого пересечения сильно зависит от вашего образца ткани, от того, что именно вы ищете, и от того, какое количество ДНК присутствует изначально. Мы уже видим, что наш положительный контроль сработал, и, похоже, наш образец также является положительным. Как видно, он начинает расти чуть позже, чем наш положительный контроль.

Нам все еще придется подождать, так как прошло всего 27 циклов, но, надеюсь, через несколько циклов мы сможем с уверенностью подтвердить положительный результат нашего образца, и тогда я смогу продолжить эксперимент. На данном этапе видно, что отрицательный контроль только начинает расти; это произошло из-за того, что я взял избыточное количество хвоста. Это позволяет быть уверенным, что любой сигнал, появившийся раньше этого избыточного отрицательного хвоста, будет положительным.

Таким образом, на данном этапе всё, что появляется перед отрицательным контролем, я буду считать положительным результатом и продолжу эксперимент. После завершения циклов ПЦР прибор проводит анализ кривых плавления. Это поможет определить состав и чистоту вашего продукта.

Таким образом можно определить, правильно ли были выбраны положительные и отрицательные образцы. Например, положительный образец будет иметь специфический острый пик температуры плавления, который соответствует амплифицированному специфическому продукту ПЦР. Любые отрицательные образцы будут иметь неспецифический широкий пик температуры плавления, соответствующий неспецифической ДНК, которая была амплифицирована в ходе ПЦР.

Я только что продемонстрировал, как мы используем набор Sigma Cyber Green для быстрой генотипизации хвостов взрослых мышей. Однако данный набор можно использовать и с различными тканями животных, волосами, слюной, а также для генотипирования хвостов мышиных эмбрионов. Мы предпочитаем этот набор из-за его высокой скорости работы.

Я могу получить данные о своем генотипе уже через час, это очень удобно и просто. Спасибо за просмотр и удачи.