Получение и характеристика 3D-биогибридных гидрогелевых биочернил на основе графена для периферической нейроинженерии

Система стволовых клеток находится под влиянием своих важных компонентов. Сохранение и дифференцировка стволовых клеток немыслимы без наличия их микроокружения. Это микроокружение, называемое нишей стволовых клеток, состоит из клеток и каркасов.

Периферическая невропатия может быть, а иногда и может быть, например, травма плечевого сплетения, различные травмы, опухоли, вегетативные аномалии, иммунное определение и метаболические заболевания. Были разработаны различные методы 3D-культивирования, чтобы обеспечить лучшую и более естественную нишу для стволовых клеток. Формирование сфероидов и 3D-биопечать являются относительно новыми и перспективными методами для 3D-культур.

3D-биопечать также может быть использована в нейроинженерных исследованиях. Следовательно, в рамках этого исследования были разработаны и изучены биочернила на основе графена и альгината / желатина на предмет их регенеративных свойств. Для начала культивируйте желейные мезенхимальные стволовые клетки Wharton или WJMSC в среде DMEM F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки или FBS, 1% перьевой / стрептококковой и 1% L-глютамина под стерильным ламинарным потоком при комнатной температуре.

Когда культивируемые клетки на 80% растворятся в колбе, налейте среду и промойте клетки пятью миллилитрами PBS. Затем добавьте пять миллилитров 0,25% трипсина и 2,21 миллимоляра натрия ЭДТА и инкубируйте при 37 градусах Цельсия. Через пять минут добавьте в ячейки 10 миллилитров среды DMEM F12, содержащей 10% FBS.

Суспендируйте клетки, соберите среду и перенесите ее в центрифужную пробирку. Затем центрифугируют клетки и выбрасывают надосадочную жидкость перед повторным посевом клеток в новую колбу со свежей питательной средой, содержащей 10% FBS. Чтобы приготовить биочернила контрольной группы без графена, взвесьте 4,5 миллиграмма альгината и 1,5 миллиграмма желатина и перенесите их в центрифужную пробирку.

Затем добавьте в пробирку 50 миллилитров среды DMEM F12, содержащей 10% FBS. Снова взвесьте 4,5 миллиграмма альгината и 1,5 миллиграмма желатина и перенесите их в центрифужную пробирку. Затем добавьте 50 микролитров 0,1% графена в пробирку и сделайте объем 50 миллилитров со средой DMEM F12, содержащей 10% FBS.

Смешайте биочернила пипеткой и вихревом перед автоклавированием при температуре 121 градус Цельсия при температуре 1,5. атмосферное давление в течение 20 минут. После автоклавирования центрифугируйте раствор, чтобы удалить образовавшиеся пузырьки, и поместите биочернила при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока клетки не будут подготовлены.

Для взаимодействия клеточных биочернил создайте группы биочернил. Первая группа включает 3D-B и 3D-G, напечатанные биочернилами для биопечати. Вторая группа включает биочернила 3D-BS и 3D-GS, на которых после биопечати образовались сфероиды.

Для первой группы посчитайте ячейки от 10 до седьмой клетки в 0,5 миллилитра среды. Затем добавьте 4,5 миллилитра биочернил. Переложите смесь в картриджи в стерильном шкафу с помощью шприцев.

Установите картриджи в соответствующую секцию экструдера биопринтера. Для второй группы возьмите по пять миллилитров биочернил из каждой из групп биочернил и перенесите их в стерильные картриджи с помощью инжектора. Используйте биопринтер с двумя коаксиальными печатающими головками и технологией экструзии с пневматическим приводом.

Установите разрешение XYZ на микрошаг на 1.25 микрометра, ширину экструзии на 400 микрометров и высоту экструзии на 200 микрометров. Используйте сетку 20 на 20 на 5 миллиметров для создания 3D-моделей. Создавайте 3D-модели с помощью веб-программ САПР с открытым исходным кодом.

Для процесса 3D-биопечати установите среднее давление принтера на 7,5 фунтов на квадратный дюйм. Затем установите температуру картриджа и станины на 37 градусов по Цельсию и скорость на 60%Переведите систему в исходное положение на этапе записи. Автоматически расположите оси, выберите и настройте экструдер перед началом процесса биопечати.

После печати извлеките образец и поместите его под ламинарный шкаф. Затем распылите биочернила 0,1 обычного раствора хлорида кальция или добавьте один миллилитр раствора пипеткой комнатной температуры и подождите от 10 до 20 секунд. Затем дважды промойте напечатанные узоры PBS, содержащим кальций и магний.

Добавьте два миллилитра среды DMEM F12 с 10% FBS поверх каждой ячейки, содержащей группу биочернил, и инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение 30 минут. Далее добавляют два миллилитра суспензионной среды, содержащей один на 10, к шестым клеткам в каждую группу и инкубируют пластинки. Через 24 часа наблюдайте и фотографируйте все партии биочернил для образования сфероидов под инвертированным микроскопом для дифференцировки WJMSC в нейроноподобные клетки, за исключением контрольной группы.

Добавьте два миллилитра среды нейрогенной дифференцировки на лунку и обновляйте каждые два дня. Наблюдайте в течение семи дней, чтобы наблюдать за нейронной дифференциацией. Затем, используя покадровую съемку, изучите влияние графена на стволовые клетки и отслеживайте клеточные взаимодействия в биочернилах.

Показано влияние концентрации графена на пролиферацию клеток. По сравнению с контролем значительное снижение наблюдалось для концентрации графена 0,001%. Существенных различий между другими группами и контролем не выявлено.

Взаимодействие клеточного графена показало, что графен переносится в 2D-системе и поглощается клетками посредством эндоцитоза. Покадровая съемка показала, что клетки, которые выжили в среде 3D-графена, сохраняли свою жизнеспособность благодаря яркости GFP до конца инкубации. Здесь показаны изображения SEM и FIIR-анализ групп биочернил 3D-B и 3D-G.

Взаимодействие клеток Bioink было продемонстрировано как на поверхности, так и внутри. Клетки были морфологически круглыми и прикреплялись к материалу. При 3D-дифференцировке нейронов считалось, что границы сфероидных клеток в обеих группах были прозрачными и живыми, а сфероиды в графеновой группе были относительно больше и улавливали графен внутри клетки.

Показано иммуноокрашивание 2D и 3D клеток. Зеленые изображения представляют собой нейроноподобные структуры. 2D-положительный контрольный образец экспрессировал меньше нейроноподобных структурных маркеров, чем 3D-образцы.

Мы обнаружили, что биочернила на основе графена были более успешными с точки зрения дифференцировки стволовых клеток в нейроноподобные клетки. Мы предполагаем, что биочернила на основе графена станут отличными инструментами для лечения заболеваний периферических нервов в дальнейших исследованиях. Сегодня система стволовых клеток может быть создана с помощью тканевой инженерии с натуральными и синтетическими биоматериалами Создание искусственных тканей, которые могут заменить живые ткани, которые могут быть использованы для регенерации этих тканей, устранения повреждений и обеспечения функции, обеспечивается тканевой инженерией.