Анализ динамики фекальной микробиоты у мышей, склонных к волчанке, с использованием простого, экономически эффективного метода выделения ДНК
2 мая 2022 г.
Этот протокол обеспечивает простой, экономически эффективный метод выделения ДНК для анализа изменений микробиоты кишечника мышей во время развития аутоиммунного заболевания.
Предложенный метод выделения ДНК может служить для изучения динамики кишечной микробиоты в аутоиммунных заболеваниях мышиных моделей. Предлагается более универсальный, экономичный и эффективный метод получения ДНК из образцов фекалий, которые сопоставимы с коммерчески доступными наборами. Для начала выньте каждую мышь индивидуально из своей клетки, соберите фекальную гранулу прямо из ануса и храните ее при минус 80 градусах Цельсия до тех пор, пока она не будет обработана.
Обработайте образцы стерильными и чистыми щипцами, трубками и перчатками. Добавьте замороженную гранулу в предварительно взвешенную двухмиллитровую шнековую колпачок и запишите вес фекалий в граммах, который должен составлять от 0,02 до 0,05 г на фекальную гранулу. Добавьте к грануле тонкий слой стеклянных шариков размером 0,1 миллиметра, 500 микролитров лизисного буфера и 200 микролитров 20% додецилсульфата натрия.
Шарик взбивает трубку в течение четырех минут в гомогенизаторе, а затем три-пять минут вихря. Центрифугируйте трубки на короткое время, чтобы устранить пузырьки и пену. Чтобы извлечь ДНК из образцов микробиоты, перенесите 350 микролитров образца супернатанта в новую, 1,5 миллилитра защелкивающуюся колпачковую трубку, без какого-либо мусора.
Добавьте 500 микролитров фенола:хлороформа:изоамилового спирта в соотношении 25:24:1 и вихрь в течение одной минуты. После центрифугирования переведите 180 микролитров верхней водной фазы в новую, 1,5-миллилитровую трубку с защелкивающейся крышкой. Добавьте 180 микролитров хлороформа, инвертируйте и перемешайте.
Из этого переведите 180 микролитров водной фазы в новую трубку с защелкивающимся колпачком. В шкаф биобезопасности добавьте 180 микролитров холодного изопропанола и 36 микролитров пяти молярного ацетата аммония. Переверните его несколько раз, чтобы перемешать, и поместите трубку на лед на 20 минут.
Откажитесь от супернатанта с последующим промывкой гранул несколько раз 500 микролитрами холодного 70%-го этанола. Выбросьте супернатант, и высушите на воздухе трубку вверх ногами на папиросной бумаге в течение 20 минут, пока гранула не станет прозрачной. Суспендировать гранулу в 50 микролитрах молекулярной воды и нагревать жидкость при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы полностью растворить крупные гранулы ДНК.
После нагрева центрифугируйте эти трубки в 3, 400 раз G в течение одной минуты, чтобы извлечь капли конденсации из крышки. Измерьте концентрацию и получите соотношение 260/280 с помощью спектрофотометра. Соотношение для ДНК хорошего качества обычно составляет от 1,8 до двух.
Центрифугируют подготовленные образцы в 600 раз G в течение одной минуты при комнатной температуре, перед замораживанием при минус 80 градусах Цельсия в течение 24 часов. Затем отправьте 20 микролитров образцов с концентрациями от одного до 50 нанограмм на микролитр в Аргоннскую национальную лабораторию для секвенирования. Штамм мыши, не имеющий рецептора CX3CR1, имеет другой состав кишечной микробиоты по сравнению с мышами MRL/lpr дикого типа, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, показывает значительные различия в определенных родах, относящихся к потенциально патогенным бактериям, таким как протеобактерии типа.
Будьте осторожны с загрязнением образца. Он должен быть стерильным. Также важна пипетка с точностью при переносе супернатанта в новую трубку.
Этот метод подходит для молекулярного анализа, такого как ПЦР, переваривание ферментов рестрикции или построение геномной библиотеки. При волчанке мы доказали сильную связь между микробиотой кишечника и прогрессированием волчанки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен простой и экономичный метод выделения ДНК для анализа изменений микробиоты кишечника мышей при развитии аутоиммунных заболеваний. Метод разработан для изучения динамики микробиоты кишечника на мышиных моделях аутоиммунных заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Микробиология
- Аутоиммунитет
Теоретические основы
- Понимание микробиоты кишечника имеет решающее значение для исследований аутоиммунных заболеваний.
- Современные методы выделения ДНК могут быть дорогостоящими и сложными.
- В данном исследовании предлагается более эффективная и экономически выгодная альтернатива.
- Образцы фекалий используются для анализа изменений микробиоты.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод экстракции ДНК из образцов фекалий.
- Облегчить изучение микробиоты кишечника в моделях аутоиммунных заболеваний.
- Сравнить эффективность нового метода с коммерчески доступными наборами.
Используемые методы
- Индивидуальный сбор фекальных пеллет у мышей.
- Хранение образцов при -80 °C.
- Использование стерильных инструментов для обработки образцов.
- Подготовка образцов с использованием лизирующего буфера и стеклянных шариков.
Основные результаты
- Предлагаемый метод обеспечивает качество ДНК, сопоставимое с коммерческими наборами.
- Он экономически эффективен и результативен для анализа микробиоты.
- Это способствует дальнейшему изучению механизмов аутоиммунных заболеваний.
Выводы
- Данный метод выделения ДНК является ценным инструментом для исследователей.
- Он позволяет изучать микробиоту кишечника при различных заболеваниях.
- Метод делает исследования в области аутоиммунитета более доступными.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежный анализ динамики микробиоты кишечника в моделях аутоиммунных заболеваний имеет решающее значение для понимания влияния факторов окружающей среды и генетики на прогрессирование заболевания. Данный экономически эффективный протокол выделения ДНК обеспечивает масштабируемую и воспроизводимую экстракцию микробной ДНК из фекальных образцов мышей, что позволяет проводить высокопроизводительные исследования микробиома в рамках доклинических исследований. Этот метод повышает достоверность прогнозов при установлении связи между изменениями микробиоты и аутоиммунными фенотипами, что способствует раннему обнаружению маркеров и разработке трансляционных стратегий.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное выявление и валидация мишени
- Позволяет изучать взаимодействия между микробиотой и иммунной системой на релевантных моделях мышей при различных заболеваниях.
- Обеспечивает функциональную валидацию потенциальных путей, на которые влияет состав кишечной микробиоты.
- Способствует механистическому снижению рисков путем установления связи между изменениями в микробиоте и прогрессированием аутоиммунных процессов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых образцов ДНК для последующего секвенирования и молекулярного анализа.
- Гарантирует получение количественной высококачественной ДНК, подходящей для ПЦР и рабочих процессов секвенирования следующего поколения.
- Позволяет масштабировать обработку образцов для сравнительных исследований микробиома в различных экспериментальных когортах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет доклиническое профилирование микробиоты с прогрессированием заболевания и поиском биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность между результатами на этапе поиска и трансляционной валидацией в моделях аутоиммунных заболеваний.
- Снижает биологическую неопределенность при установлении связи между экологическими триггерами и фенотипами заболеваний.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный протокол изоляции ДНК применим на этапе от ранних открытий до доклинических исследований, что позволяет проводить надежный анализ микробиома на моделях мышей, предрасположенных к системной красной волчанке, а также способствует идентификации перспективных соединений и проведению исследований механизмов действия.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез об иммуномодуляции под воздействием микробиоты при аутоиммунитете.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные выходы ДНК для профилирования микробиома на основе секвенирования.
- Аналитика: предоставляет высококачественные данные для статистического сравнения сдвигов в микробном сообществе между генотипами или вариантами лечения.
- Трансляционные исследования: связывает доклинические данные о микробиоме с возможной разработкой биомаркеров аутоиммунных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: предлагает масштабируемый и экономически эффективный протокол, адаптируемый к различным мышиным моделям и схемам экспериментов.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования ассоциаций между микробиотой и заболеваниями, а также валидацию мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует экстракцию ДНК, повышая воспроизводимость и масштабируемость исследований.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет уточнения вклада микробиома в механизмы развития заболеваний.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию интервенций по модуляции микробиома в рамках разработки препаратов для лечения аутоиммунных заболеваний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется технический опыт работы со стерильными образцами и знание процессов молекулярной биологии.
- Необходим доступ к гомогенизаторам, центрифугам и спектрофотометрам для контроля качества.
- Требуется строгая стандартизация между группами исследователей для минимизации контаминации и вариабельности.
- Метод адаптируем к различным моделям мышей, однако может потребоваться оптимизация для разных типов образцов.
- Точность дозирования при пипетировании и соблюдение правил стерильности являются определяющими для обеспечения целостности данных.
