Биомолекулярная визуализация клеточного поглощения наночастиц с использованием мультимодальной нелинейной оптической микроскопии

Наш протокол представляет собой мультимодальную, нелинейную, оптическую микроскопию и применяет ее для выполнения химически специфической визуализации наночастиц золота в раковых клетках. Основным преимуществом нашей системы визуализации является то, что ее можно использовать для обзора биомолекулярного контраста клеточных структур и наночастиц золота мультимодальным способом. Для начала включите вилки всего оборудования, кроме пульта дистанционного управления.

Затем включите заднюю часть коробки и нажмите «Начать операцию» после того, как индикатор пульта дистанционного управления загорится синим цветом. После этого включите ПК лазерного сканирующего микроскопа и запустите программное обеспечение конфокального микроскопа. Затем проверьте световой путь микроскопа с помощью компьютерного программного обеспечения и управляйте фокусом через сенсорный экран или ручки дистанционного управления или компьютерное программное обеспечение.

Выберите нужные параметры изображения в программном обеспечении, включая Масштабирование, Размер изображения в пикселях и Время ожидания пикселя, гарантируя, что время ожидания пикселя больше, чем время интеграции. Поместите каплю дистиллированной воды поверх объектива погружения в воду, который фокусирует лазерные лучи в образце и между конденсатором и образцом для визуализации. Затем отрегулируйте высоту конденсатора примерно на один миллиметр над образцом, чтобы собрать максимальное количество света и переместить детектор SRS, размещенный на подвижном креплении, из траектории луча, чтобы сфокусироваться на образце с использованием белого света.

Используя настройки программного обеспечения, выберите луч накачки и измените длину волны лазера до 802 нанометров для колебаний CH и 898 нанометров для амидного пика I, учитывая большие изменения в рамановском сдвиге. Чтобы добиться небольших корректировок в рамановском сдвиге, отсканируйте стадию задержки в блоке SFTRU, как описано в рукописи. Для набора гиперспектральных данных выберите вкладку Триггер, нажмите кнопку Запустить по триггеру ttl, а затем выберите Активировать каждый кадр.

Затем на вкладке Серия установите временные ряды и Z-ряды. Кроме того, установите количество кадров во временном ряду, чтобы оно соответствовало количеству шагов в программном обеспечении ATM. После этого перейдите на вкладку «Выполнить» в программном обеспечении банкомата и установите позиции стадии задержки для CH на 90,25 и 92,25, тогда как для области амида I на 89 и 91 в миллиметрах, соответствующие начальному и стоп-положению гиперспектрального сканирования, при этом количество шагов соответствует количеству кадров в компьютерном программном обеспечении.

После проверки правильных настроек запустите гиперспектральный стек в программном обеспечении компьютера, сначала перейдя в Acquire, а затем нажав кнопку Начать сканирование. Затем в программном обеспечении банкомата нажмите кнопку Пуск, которая инициирует сбор серии изображений с постепенным увеличением положения этапа задержки между выбранными начальной и стоп-позицией. Затем сделайте временный ряд изображений в разных положениях стадии задержки, чтобы создать гиперспектральное сканирование.

Используя аналоговый блок, отправляйте и принимайте сигналы ttl в систему SFTRU и из нее для синхронизации получения изображений и движения ступени задержки. Для переключения между изображениями в вибрационной области CH и амидной вибрационной областью I измените длину волны накачки в лазерном программном обеспечении с 802 нанометров до 898 нанометров. Кроме того, измените настройку дисперсии Стокса в программном обеспечении ATM с 30 миллиметров до 5 миллиметров.

Отрегулируйте нижнюю ручку на зеркальном креплении, чтобы сделать небольшую корректировку зеркала в пути рассеивания пучка насоса внутри коробки SFTRU, изменив угол зеркала с добавочной величиной. Для подтверждения химической селективности микросфер полистирола регистрировали гиперспектральное стимулированное рамановское рассеяние и спонтанные рамановские спектры. Спектры были идентичны, за исключением разницы, наблюдаемой в относительной интенсивности.

Стимулированная рамановская рассеянная визуализация раковых клеток 4T1 выполнялась при 2, 852, 2, 930 и 2, 968 волновых числах, соответствующих углерод-водородной растягивающей колебательной полосе липидных, белковых и ДНК биомолекул. Мультимодальная визуализация раковых клеток 4T1, дозированных наночастицами золота, была выполнена для исследования распределения наночастиц в раковых клетках. Полученные стимулированные рамановские изображения рассеяния были получены для канала CH2 и CH3, флуоресцентных зондов LysoTracker и внерезонансного стимулированного канала рамановского рассеяния.

Самое главное, что нужно помнить, это изменить вибрационную область, опорный насос в лазерном программном обеспечении, а также настройку дисперсии Стокса во время протокола. Эту систему можно легко переключать с фемтосекундной на пикосекундную область, не влияя на оптическое выравнивание. Эта возможность позволяет нам выполнять многофотонное когерентное рамановское рассеяние и зондовую спектроскопию насоса и их приложения.

Эта мультимодальная платформа визуализации предоставляет новое понимание наномедицины и прокладывает путь для молекулярной визуализации клеток, тканей и наночастиц золота.