Name: Исследование пространственного взаимодействия между астроцитами и нейронами в очищенном мозге (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Изучите метод CLARITY для визуализации пространственных взаимодействий между астроцитами и нейронами в гиппокампе мыши. Этот протокол позволяет анализировать сотни клеток в прозрачной ткани мозга.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 803589), Израильского научного фонда (грант ISF No 1815/18) и канадско-израильских грантов (CIHR-ISF, грант No 2591/18). Мы благодарим Нехаму Новика за комментарий ко всей рукописи.

Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Еврейским университетом и соответствовали руководящим принципам Руководства Национального института здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию.
1. Вирусная векторная трансдукция
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусная векторная трансдукция используется для экспрессии флуорофоров в головном мозге.
<ol><li>Используйте атлас (например, Allen Brain Atlas) для определения соответствующей координации целевой области. ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-атласы можно найти в Интернете (например, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).</li>
	<li>Используя стереотаксическую хирургию, вводите вирусные векторы в соответствующую структуру мозга. Подробный протокол см. вразделе 9 .</li>
	<li>Подождите 3-6 недель для выражения флуорофора. ПРИМЕЧАНИЕ: Короткого периода времени достаточно, если необходимо отметить только тела клеток. Потребуется длительный период времени, если аксональные проекции имеют отношение к вопросу, так как флуорофорам требуется больше времени для экспрессии в аксонах, которые могут иметь длину в несколько миллиметров.</li>
	<li>Заранее проверьте специфичность и пенетрантность экспрессии флуорофоров (как вирусной экспрессии, так и ТГ животных) (рисунок 1А). Прежде чем приступить к процедуре CLARITY, назначьте по крайней мере один мозг для тонких срезов и убедитесь, что экспрессия флуорофора является сильной и специфичной для особенности клетки-мишени.</li>
</ol>2. ЯСНОСТЬ
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод делает мозг прозрачным в течение 2-6 недель.
<ol><li>Выполняйте транскраниальную перфузию на животных с использованием холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) с последующим 4% параформальдегидом (PFA) в PBS. Удалите мозг и храните его в PFA на ночь при 4 °C в трубке 50 мл или аналогичном контейнере. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением транскраниальной перфузии животное должно быть глубоко обезболено. В примерах, представленных в этом протоколе, всех животных анестезировали с использованием кетамина и ксилазина (90% и 10% соответственно).</li>
	<li>Заменить PFA раствором гидрогеля (HS; см. таблицу 1) в течение 48 ч при 4 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте материалам стать теплее, чем температура охлаждения (4-8 ° C) на этом этапе, иначе гидрогель полимеризуется. HS, используемый в этом протоколе, содержит 2% акриламида, в отличие от предыдущих протоколов, предполагающих 4% 22 или 1% 17. Выгода в 2% подробно описана в разделе обсуждения. При подготовке ТН ВЭД работают на ледяной поверхности. Храните при -20 °C.</li>
	<li>Дегазация ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого этапа является удаление всего свободного кислорода из ткани, поскольку O2 препятствует процессу полимеризации. Может быть использован любой газ, неотносящийся к О2 (например, N2, CO2); Рекомендуется N2 .<ol>
<li>Перенесите N2 из резервуара через 5 мм (внутреннюю) гибкую трубку, соединенную с иглой 19 G на ее конце (рисунок 1B).</li>
		<li>Сделайте два небольших отверстия (шириной от иглы) в крышке трубки: одно для введения газа, а другое, чтобы позволить воздуху покинуть трубку (рисунок 1C).</li>
		<li>Прикрепите трубу от газа N2 к трубке и замените газы примерно на 30 мин при комнатной температуре (RT).</li>
		<li>Снимите трубу и немедленно запечатайте отверстия с помощью моделирующей глины на каждой трубке (рисунок 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Переместите дегазированные герметичные трубки в ванну с температурой 37 °C в течение 3,5 ч для полимеризации HS, который станет гелем. Будьте осторожны, чтобы не встряхнуть трубки (рисунок 1E).</li>
	<li>Извлеките мозг из трубки и аккуратно удалите полимеризованный гель вокруг нее с помощью лабораторных салфеток. Убедитесь, что к поверхности ткани не осталось остаточного геля, так как он может вступить в реакцию с раствором на следующих этапах, ингибируя процесс очистки тканей (рисунок 1F). ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку гель содержал PFA, экстракция должна производиться под вытяжным кожухом.</li>
	<li>Нарежьте мозг, если рассматриваемый вопрос требует только его части. Разделите его пополам или на очень толстые срезы, которые содержат все интересующие области (рисунок 1G).</li>
	<li>Поместите ломтики в первый очищающий раствор (CS1, см. таблицу 2) в новый контейнер и встряхните при 70 об/мин в течение 24 ч при 37 °C.</li>
	<li>Выполните описанные ниже шаги, чтобы перевести мозг из CS1 во второе очищающее решение (CS2, см. таблицу 2).<ol>
<li>Заранее подготовьте перфорированную трубку для мозга (рисунок 1Н).</li>
		<li>Разогрейте CS2 до 40-45 °C в стакане, достаточно большом, чтобы вместить трубку. Делайте это на конфорке с мешалкой. Убедитесь, что температура не достигает 55 °C, чтобы предотвратить отбеливание экспрессированных белков.</li>
		<li>Поместите стакан, заполненный CS2, и перфорированную трубку на перемешивающее устройство (стакан объемом 2 л на рисунке 1I). Установите умеренную скорость перемешивания, которая заставит жидкость течь, не искажая ткань. ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 2-6 недель ткань станет прозрачной (процесс начинается на периферии и движется внутрь к центральным структурам мозга). Решение о том, когда ткань «достаточно чистая», зависит от личного суждения. Мозг должен быть достаточно прозрачным для визуализации под микроскопом без помех (рисунок 1J недостаточно четкий; Рисунок 1K достаточно четкий). Превышение точки, в которой ткань достаточно прозрачна, может привести к потере жесткости ткани.</li>
	</ol></li>
	<li>Перевести из CS2 в PBST (0,5% Triton X-100 в PBS, см. Таблицу 2) в новом контейнере при 37 °C с легким встряхиванием (70 об/мин) в течение 24 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: В PBST ткань станет беловатой (рисунок 1L). Ясность вернется (и улучшится) при внедрении в решение для согласования показателей преломления (RIMS, см. шаг 2.14).</li>
	<li>Замените PBST новым PBST. Хранить в тех же условиях (37 °C при легком встряхивании) еще 24 ч.</li>
	<li>Замените PBST снова на новый PBST и держите на RT в течение 24 часов.</li>
	<li>Перевод в PBS на RT в течение 24 ч.</li>
	<li>Замените PBS и оставьте в RT еще на 24 часа.</li>
	<li>Извлеките мозг из PBS и перенесите его в RIMS при 37 °C в течение ночи. ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально рябь в RIMS может окружать мозг. Этот протокол был разработан и проверен с использованием двух конкретных коммерческих RIMS (см. таблицу 3). Однако протокол не должен отличаться при использовании других RIMS (коммерческих или самодельных).</li>
	<li>Держите ткань на RT еще 24 ч или до тех пор, пока раствор не достигнет полного равновесия, т. е. когда ткань станет прозрачной, и раствор больше не будет содержать видимой ряби (рисунок 1M).</li>
	<li>Если ткань прозрачная, приступайте к камерной подготовке. Если в этот момент ткань становится белой, а не прозрачной (из-за агрегатов остаточных молекул SDS), снова очистите образец, повторив шаги 2.9 и 2.10, и перенесите ткань в CS2 (шаг 2.8) в течение нескольких дней, а затем все этапы до шага 2.15.</li>
</ol>3. Подготовка камеры
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется слайд с камерой визуализации, в которую будет помещен образец.
<ol><li>Поместите образец в середину слайда.</li>
	<li>Используя горячий клеевой пистолет, создайте стенки по краям затвора, почти такие же высокие, как ткань. Обязательно оставьте небольшой зазор (примерно 5 мм) в одном из углов (рисунок 2A,B).</li>
	<li>Нанесите 1-2 капли RIMS на образец, чтобы сохранить верхнюю поверхность влажной и предотвратить образование пузырьков между покровным листом и тканью.</li>
	<li>Сразу после нанесения капель RIMS добавьте последний слой горячего клея к стенкам (чтобы они достигли высоты мозга/среза) и сразу же прогрессируйте (пока горячий клей еще жидкий) к шагу 3.5.</li>
	<li>Запечатайте верхнюю часть чехлом, поместив его как можно более равномерно поверх еще теплого слоя горячего клея (рисунок 2C).</li>
	<li>Заполните камеру RIMS через зазор, оставленный в стенках горячего клея (рисунок 2D,E).</li>
	<li>Закройте зазор горячим клеем. Не оставляйте воздуха внутри (рисунок 2F).</li>
	<li>Если стенки горячего клея выходят за границы горки, вырежьте расширяющиеся края (рисунок 2G).</li>
	<li>Если объектив, используемый для визуализации, погружен, добавьте еще 2-3 мм клея к стенам над крышкой, чтобы погружной раствор прослужил более длительный период (рисунок 2H).</li>
</ol>4. Визуализация (конфокальная или двухфотонная)
<ol><li>Проверьте, может ли ступень удерживать камеру, так как толщина камеры может достигать нескольких миллиметров. ПРИМЕЧАНИЕ: Например, конфокальный микроскоп (см. Таблицу материалов), используемый в этом протоколе, оснащен несколькими ступенями (например, круговой, прямоугольной). Какая бы ступень ни была выбрана для хранения камеры, она не имеет значения, если ее параметры соответствуют размерам камеры.</li>
	<li>Работа с объективом с достаточным рабочим расстоянием, т.е. минимальным рабочим расстоянием ≥3 мм, так как интересующая область мозга может быть несколько миллиметров в глубину, а крышка может быть не совсем прямой, как это было размещено вручную. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве демонстрации результаты, представленные на рисунке 1, видео 1 и видео 2 , были получены под двухфотонным микроскопом с использованием объектива погружения в воду 16x с рабочим расстоянием 3 мм и увеличением 2,4 для получения поля зрения 652 x 483 мкм и z-стека с интервалами 0,937 мкм между плоскостями.</li>
	<li>Выполните многозонную визуализацию, которая может занять несколько часов или даже дней. Убедитесь, что на компьютере достаточно свободного места, так как размер каждого изображения может достигать десятков гигабит. ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация CLARITY может привести к значительно большему количеству участков изображения в глубине. Поэтому интенсивности, используемые для захвата выражения, должны быть относительно низкими, чтобы предотвратить чрезмерную экспрессию во время суммирования изображения.</li>
	<li>Для целей погружения регулярно проверяйте жидкость во время визуализации и при необходимости добавляйте дополнительную жидкость. ПРИМЕЧАНИЕ: Во время визуализации данных, представленных в Видео 3, вода добавлялась на поверхность камеры каждые 6-8 ч для борьбы с испарением.</li>
	<li>После получения изображения просмотрите и проанализируйте его с помощью нескольких различных пакетов программного обеспечения. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое программное обеспечение включает Imaris и SyGlass как для визуализации, так и для анализа. Точный конвейер для оптимизированной реконструкции астроцитов с использованием программного обеспечения Imaris был описан ранее9. Короче говоря, особенностями Имариса, используемыми в этом исследовании, были нити для полной реконструкции клеточных структур и пятна для извлечения положения в пространстве всех сомат.</li>
</ol>

<ol><li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li>
<li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema%2C+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).</li>
<li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li>
<li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li>
<li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+in+memory+function%3A+pioneering+findings+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li>
<li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li>
<li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915(2016).</li>
<li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit-specialized+astrocytes%3A+transcriptomic%2C+proteomic%2C+morphological%2C+and+functional+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Методы очистки тканей представляют собой революционный инструмент в исследованиях мозга, вызывая вопросы, которые ранее не могли быть заданы. Нацеливаясь на свойства небольшой группы клеток, одной клетки или даже одного синапса, CLARITY теперь позволяет нацеливаться на общие популяции клеток или функции связи на большие расстояния с помощью соответствующих флуорофоров.
Результат комбинации экспрессии флуорофора и процедуры CLARITY не является бинарным; многие факторы могут мешать процедуре, чт...

В последние годы знания о функции астроцитов и о том, как они взаимодействуют с нейронными цепями, резко возросли. Астроциты могут влиять на пластичность 1,2, помогать в восстановлении нейронов после травмы 3,4 и даже индуцировать de novo нейрональное потенцирование, причем недавние исследования демонстрируют важность астроцитов в приобретении памяти и вознаграждении, ранее рассматриваемых как чисто нейронные функции 5,6,7 . Особенностью, представляющей особый интерес в исследованиях астроцитов, является пространственное расположение клеток, которые поддерживают уникальные пространственные организации в гиппокампе и других структурах мозга 8,9,10. В отличие от нейрональных дендритов, которые переплетаются между клеточными соматами, астроциты гиппокампа населяют визуально различимые территории с небольшим перекрытием между их процессами, создавая отчетливые домены 8,11,12,13. Доказательства, подтверждающие участие астроцитов в нейронных цепях, не подтверждают отсутствие подробного анатомического описания таких популяций и нейронов в их доменах14.
Процедуры трансдукции вирусных векторов, наряду с трансгенными животными (ТГ), были популяризированы в качестве набора инструментов для исследования структур, функций и клеточных взаимодействий мозга15,16. Использование различных промоторов позволяет нацеливаться на конкретные клетки в соответствии с их генетическими свойствами, уровнями активации17,18 или проекционными мишенями. Различные вирусы могут экспрессировать различные цветные флуорофоры в разных популяциях. Вирус может сочетаться с эндогенной экспрессией флуорофоров в ТГ, или ТГ животных можно использовать без необходимости в вирусах. Эти методы широко используются для маркировки нейронов, и некоторые лаборатории начали использовать их с модификациями, специализированными для нацеливания на другие типы клеток, такие как астроциты 5,9,19.
Метод CLARITY, впервые описанный в 2013 году20,21, позволяет изучать толстые срезы мозга, делая весь мозг прозрачным, оставляя микроскопические структуры нетронутыми. Объединив два метода — вирусную векторную трансдукцию и очистку тканей — теперь доступен вариант изучения пространственных взаимодействий между различными популяциями клеточных типов. Большинство исследований взаимодействия астроцитов и нейронов проводились на тонких срезах мозга, что приводило к изображениям неполных астроцитов из-за их больших доменов, тем самым радикально ограничивая количество анализируемых клеток. Использование метода CLARITY позволяет одновременно характеризовать одноклеточные популяции клеток в крупномасштабных объемах. Визуализация флуоресцентно помеченных клеточных популяций в чистом мозге не обеспечивает синаптического разрешения, но позволяет тщательно охарактеризовать пространственные взаимодействия между астроцитами и различными типами нейрональных клеток.
По этой причине мы использовали эти современные методы для исследования свойств астроцитов по всему дорсальному CA1, визуализируя всю пластинку (Stratum Radiatum, пирамидальный слой и Stratum Oriens). Мы измерили десятки тысяч астроцитов (с вирусной пенетрантностью >96%5), тем самым проанализировав информацию всей астроцитарной популяции вокруг CA1. При эффективном проникновении нейронных маркеров мы могли бы регистрировать взаимодействия между всей популяцией астроцитов CA1 и четырьмя типами нейронных клеток — парвальбумином (PV), соматостатином (SST), VIP-тормозными нейронами и возбуждающими пирамидальными клетками9.
Несколько экспериментов были проведены с использованием комбинации флуоресценции животных ТГ и разноцветных вирусных векторов (все ингибирующие клетки), в то время как другие (возбуждающие) использовали два вирусных вектора, экспрессирующих разные флуорофоры под разными промоторами9. В этой статье представлен подробный протокол, включая маркировку желаемых клеток в мозге, обеспечение прозрачности мозга с помощью модифицированной процедуры CLARITY, а также визуализацию и анализ полных структур мозга с использованием различных процедур и программного обеспечения.

<table><tbody><tr><td>AAV1-GFAP::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>вирусный вектор, используемый для обнаружения астроцитов</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>вирусный вектор, используемый для обнаружения нейронов</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>вирусный вектор, используемый для обнаружения ядер нейронов</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>вирусный вектор, используемый для обнаружения нейронов</td></tr><tr><td>Акриламид (40%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Бисакриламид (2%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Борная кислота</td><td>Сигма</td><td>#B7901</td><td>Молекулярная масса - 61,83 г/моль</td></tr><tr><td>Конфокальный микроскоп, сканирование, объектив FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>4x (UPlanSApo, 0,16 NA)</td></tr><tr><td>Программное обеспечение</td> <td>ImarisBitplane, Великобритания</td><td></td><td>Программное обеспечение, позволяющее проводить 3D-анализ изображений</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S5881</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA 4%</td><td>EMS</td><td>#15710</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin lab</td><td>#RC147002</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear CS</td><td>SunJin lab</td><td>#RCCS002</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>#L3771</td><td></td></tr><tr><td>Программное обеспечение</td><td></td><td></td> SyGlass <td>Программное обеспечение, позволяющее проводить 3D-анализ изображений с использованием виртуальной реальности</td></tr><tr><td>Tris base 1 M</td><td>Bio-rad</td><td>#002009239100</td><td>Молекулярная масса - 121,14 г/моль</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ChemCruz</td><td>#sc-29112A</td><td></td></tr><tr><td>Двухфотонный микроскоп</td><td>Neurolabware</td><td></td><td>Ti:сапфировый лазер (Chameleon Discovery TPC, Coherent), фотоумножитель GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), полосовой фильтр (Semrock), объектив с водяным погружением 16x (Nikon, 0.8 NA)</td></tr><tr><td>VA-044 Инициатор</td><td>Wako</td><td>#011-19365</td><td></td></tr></tbody></table>

Исследование пространственного взаимодействия между астроцитами и нейронами в очищенном мозге

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Сочетание вирусной векторной трансдукции и очистки тканей с помощью метода CLARITY позволяет одновременно исследовать несколько типов клеток головного мозга и их взаимодействия. Вирусная векторная трансдукция позволяет маркировать различные типы клеток различными цветами флуоресценции в одной и той же ткани. Клетки могут быть идентифицированы генетически по активности или проекции. Используя модифицированный протокол CLARITY, потенциальный размер выборки астроцитов и нейронов вырос на 2-3 порядка. Использование CLARITY позволяет визуализировать полные астроциты, которые слишком велики, чтобы поместиться в них целиком в срезы, и исследовать соматы со всеми их процессами. Кроме того, он дает возможность исследовать пространственное взаимодействие между астроцитами и различными типами нейрональных клеток, а именно количество пирамидных нейронов в каждом астроцитарном домене или близость между астроцитами и специфическими ингибирующими популяциями нейронов. В настоящем документе подробно описывается, как должны применяться эти методы.

Успешная очистка толстых срезов мозговой ткани приводит к новому кругу вопросов, которые можно задать относительно свойств больших клеточных популяций в отличие от свойств отдельных клеток или соседних групп клеток. Для достижения успешных результатов следует строго придерживаться протокола CLARITY, так как существует широкий спектр параметров, которые необходимо учитывать для уменьшения дисперсии между образцами (например, процент четкости, информация о флуоресценции, параметры опухания).
<st...

Сочетание вирусной векторной трансдукции и очистки мозга с помощью метода CLARITY позволяет исследовать большое количество нейронов и астроцитов одновременно.

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Техника ясности, впервые описанная в 2013 году, представляет собой технику очистки тканей, которая позволяет проводить выборку большего количества клеток, кровеносных сосудов, поэтому даже белки такого разрешения одной клетки в толстых срезах мозга. Этот метод позволяет изучать неповрежденные микроскопические структуры, делая весь мозг прозрачным. Этот протокол представляет собой простой чип и прямой конвейер для очистки тканей.Этот метод может быть использован для очистки тканей в других системах в дополнение к тканям мозга. Для начала запечатайте трубку и колпачок с помощью парапленки и проколите два отверстия в колпачке. Затем перенесите газообразный азот из резервуара с помощью гибкой трубы с внутренним диаметром пять миллиметров и 19-метровой иглой, соединенной на ее конце.Начните дегазацию, прикрепив трубу к трубе и обеспечив газообмен в течение 30 минут при комнатной температуре. Отсоедините трубу и сразу же заделайте отверстия пластичной глиной. Затем переложите герметичные трубки дегаза в ванну с температурой 37 градусов Цельсия в течение 3 1/2 часов для полимеризации раствора гидрогеля.Выньте мозг из трубки. Используя лабораторные салфетки, удалите полимеризованный гидрогель вокруг мозга, гарантируя, что остаточный гель не останется прикрепленным к поверхности мозга. Разделите мозг на толстые срезы, которые содержат все области, представляющие интерес.Поместите ломтики в первый очищающий раствор и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с вращением при 70 об/мин в течение 24 часов. А пока подготовьте перфорированную трубку для размещения мозга. Поместите перфорированную трубку в стакан, наполненный вторым очищающим раствором на перемешивающем устройстве.Затем поместите мозг в стакан и запечатайте его алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить отбеливание. После того, как ткань станет прозрачной, переведите мозг в ПБСТ в инкубации при 37 градусах Цельсия с вращением при 70 об/мин в течение 24 часов. Замените раствор свежим ПБСТ и продолжайте инкубацию еще 24 часа.Затем переведите мозг на PBS при комнатной температуре в течение 24 часов. Через 24 часа удалите мозг из PBS и переведите его в раствор для сопоставления показателей рефракции. Инкубируйте мозг при температуре 37 градусов по Цельсию в течение ночи.Сначала поместите образец в середину слайда. Используя горячий клей, создайте стенки по краям горки, почти такие же высокие, как ткань. Обязательно оставьте небольшой зазор в одном из углов.Когда слой горячего клея приближается к высоте мозгового среза, нанесите одну-две капли раствора, соответствующего показателю преломления, на образец, чтобы увлажнить верхнюю поверхность и предотвратить образование пузырьков. Пока горячий клей еще жидкий, запечатайте верхнюю часть крышкой, поместив ее как можно более равномерно, а затем заполните камеру раствором, соответствующим показателю преломления. Закройте зазор горячим клеем.Если горячий клей стенок выходит за границы горки, срежьте выдвижные края. Если для визуализации используется масляный погружной объектив, добавьте еще два-три миллиметра клея к стенам над крышкой, чтобы сохранить раствор погружения. После этого протокола ткань мозга будет очищена.Чистые срезы мозга были подготовлены с использованием этого протокола для визуализации популяций астроцитов и нейронов в области CA1 гиппокампа мыши. Все астроциты экспрессировали tdTomato, а возбуждающие нейроны экспрессировали H2B-GFP в своих ядрах. Камера, подготовленная для осветленной ткани, была оптимальной для визуализации под двухфотонным или конфокальным микроскопом.Используя двухфотонный микроскоп, более 300 астроцитов наблюдались в очищенном участке области CA1 гиппокампа мыши. Астроциты гиппокампа в красных и пирамидальных клетках, соматы зеленого цвета были видимыми и толстыми, прозрачными тканями, представляющими пространственную близость между этими двумя типами клеток. С помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа аксональные пучки из возбуждающих нейронов были прослежены по всему полушарию.Зеленые пучки были прослежены от спинного гиппокампа к супермальярным телам. Красные пучки были прослежены от мамиллярных тел к их происхождению в вентиляционном гиппокампе. Такие факторы, как температура, концентрации и время инкубации, повлияли на результат процедуры ясности.Поэтому точность каждого шага протокола имеет жизненно важное значение для успеха достижения чистой ткани. Используя эту технику, мы измеряем расстояния между нейронами и астроцитами в нескольких структурах мозга. Этот протокол позволил проанализировать на два-три порядка больше клеток, чем в предыдущих исследованиях.

investigation-spatial-interaction-between-astrocytes-neurons-cleared

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Нейронауки

Данное исследование описывает процедуры создания новых нейронных аксонов и (ASTRO) глии совместного культивирования платформы. В этой совместной системе культуры, манипуляции прямого взаимодействия между одним аксона (и единственной глиальных клеток) становится возможным, позволяя механистического анализа взаимного нейрона к глиальных сигнализации.

Анализ изображений нейрона к Glia Взаимодействие в Микрофлюидных Платформа культуры (MCP) на основе нейронных аксонов и глии Co-культуре системы

Это видео иллюстрирует метод установления непрямой культуры нейронов и астроцитов с использованием компартментализованного подхода. В этой конфигурации нейроны и астроциты пространственно разделены, но имеют общую кондиционированную среду. Нейротрофические факторы, высвобождаемые астроцитами, способствуют дифференцировке нейронов и формированию синаптических связей, что свидетельствует о взаимодействии нейронов и глии.

Метод непрямого сокультивирования нейронов и астроцитов для изучения взаимодействий нейронов и глии

Источник: Рафаэли, Р., и др., исследование пространственного взаимодействия между астроцитами и нейронами в очищенном мозге. J. Vis. Exp. (2022)} В видео демонстрируется приготовление камеру и нейровизуализацию очищенной ткани гиппокампа мыши с помощью двухфотонной микроскопии для визуализации пространственных взаимодействий между флуоресцентно мечеными астроцитами и возбуждающими нейронами.

Двухфотонная микроскопия астроцитов и возбуждающих нейронов в очищенной ткани гиппокампа мыши

Астроциты в ЦНС изменяют свои функциональные и структурные свойства в ответ на вредные раздражители. В данном отчете представлен протокол оценки морфологии трехмерных астроцитов при заболеваниях или после терапевтических вмешательств.

Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

Этот протокол описывает косвенную нейрон-астроцитов сокультивирования для анализа на секции нейрон-глиальных взаимодействий.

Непрямой Нейрон-астроцитов Анализ Совместное культивирование:<em&gt; In Vitro</em&gt; Настройка для детального исследования Нейрон-глии взаимодействий

Мы витрина развития собственн-собранные, трехмерные связки продольно соответствие Астроцитарная somata и процессов в рамках Роман биоматериала оболочки. Эти инженерии «живые леса», экспонируется микрон шкала диаметр еще расширение сантиметров в длину, могут служить в качестве тест кровать изучения механизмов психомоторного развития или облегчить neuroregeneration направляющие нейронной миграции и/или аксональное Поиск пути.

Трехмерные ткани спроектированы в соответствие экзоцитоз сетей для пилки развития механизмов и содействия регенерации нервной системы

Здесь мы представляем протокол для оценки Организации Астроцитарная сетей. Описан метод минимизирует смещения для предоставления описательного мер этих сетей таких клеток, размер, площадь и позиция в ядра. Анизотропия оценивается с векторного анализа.

Анализируя размер, форму и направленность сетей спаренных астроциты

Описанный конвейер предназначен для сегментации наборов данных электронной микроскопии больше гигабайт, для извлечения морфологий из целых клеток. После реконструкции ячеек в 3D, индивидуальное программное обеспечение, разработанное вокруг индивидуальных потребностей, может быть использовано для выполнения качественного и количественного анализа непосредственно в 3D, также используя виртуальную реальность для преодоления окклюзии зрения.

Метод 3D-реконструкции и анализа виртуальной реальности глиальных и нейрональных клеток

Здесь мы описываем метод живой визуализации in vitro для визуализации внутриклеточного переноса органелл и оборота плазменных мембранных белков в murine astrocytes. В этом протоколе также представлена методология анализа изображений для определения маршрутов грузовых перевозок и кинетики.

Визуализация и анализ внутриклеточного переноса органелл и других грузов в астроцитах

Этот протокол описывает методы секционирования, окрашивания и визуализации свободно плавающих участков тканей мозга мыши с последующим подробным описанием анализа объема территории астроцитов и перекрытия территории астроцитов или облицовки.

Анализ объема территории астроцитов и укладки плитки в толстых свободно плавающих участках тканей

Изучите метод CLARITY для визуализации пространственных взаимодействий между астроцитами и нейронами в гиппокампе мыши. Этот протокол позволяет анализировать сотни клеток в прозрачной ткани мозга.

Исследование пространственного взаимодействия между астроцитами и нейронами в очищенном мозге

Больше видео