Исследование пространственного взаимодействия между астроцитами и нейронами в очищенном мозге
31 марта 2022 г.
Сочетание вирусной векторной трансдукции и очистки мозга с помощью метода CLARITY позволяет исследовать большое количество нейронов и астроцитов одновременно.
Техника ясности, впервые описанная в 2013 году, представляет собой технику очистки тканей, которая позволяет проводить выборку большего количества клеток, кровеносных сосудов, поэтому даже белки такого разрешения одной клетки в толстых срезах мозга. Этот метод позволяет изучать неповрежденные микроскопические структуры, делая весь мозг прозрачным. Этот протокол представляет собой простой чип и прямой конвейер для очистки тканей.
Этот метод может быть использован для очистки тканей в других системах в дополнение к тканям мозга. Для начала запечатайте трубку и колпачок с помощью парапленки и проколите два отверстия в колпачке. Затем перенесите газообразный азот из резервуара с помощью гибкой трубы с внутренним диаметром пять миллиметров и 19-метровой иглой, соединенной на ее конце.
Начните дегазацию, прикрепив трубу к трубе и обеспечив газообмен в течение 30 минут при комнатной температуре. Отсоедините трубу и сразу же заделайте отверстия пластичной глиной. Затем переложите герметичные трубки дегаза в ванну с температурой 37 градусов Цельсия в течение 3 1/2 часов для полимеризации раствора гидрогеля.
Выньте мозг из трубки. Используя лабораторные салфетки, удалите полимеризованный гидрогель вокруг мозга, гарантируя, что остаточный гель не останется прикрепленным к поверхности мозга. Разделите мозг на толстые срезы, которые содержат все области, представляющие интерес.
Поместите ломтики в первый очищающий раствор и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с вращением при 70 об/мин в течение 24 часов. А пока подготовьте перфорированную трубку для размещения мозга. Поместите перфорированную трубку в стакан, наполненный вторым очищающим раствором на перемешивающем устройстве.
Затем поместите мозг в стакан и запечатайте его алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить отбеливание. После того, как ткань станет прозрачной, переведите мозг в ПБСТ в инкубации при 37 градусах Цельсия с вращением при 70 об/мин в течение 24 часов. Замените раствор свежим ПБСТ и продолжайте инкубацию еще 24 часа.
Затем переведите мозг на PBS при комнатной температуре в течение 24 часов. Через 24 часа удалите мозг из PBS и переведите его в раствор для сопоставления показателей рефракции. Инкубируйте мозг при температуре 37 градусов по Цельсию в течение ночи.
Сначала поместите образец в середину слайда. Используя горячий клей, создайте стенки по краям горки, почти такие же высокие, как ткань. Обязательно оставьте небольшой зазор в одном из углов.
Когда слой горячего клея приближается к высоте мозгового среза, нанесите одну-две капли раствора, соответствующего показателю преломления, на образец, чтобы увлажнить верхнюю поверхность и предотвратить образование пузырьков. Пока горячий клей еще жидкий, запечатайте верхнюю часть крышкой, поместив ее как можно более равномерно, а затем заполните камеру раствором, соответствующим показателю преломления. Закройте зазор горячим клеем.
Если горячий клей стенок выходит за границы горки, срежьте выдвижные края. Если для визуализации используется масляный погружной объектив, добавьте еще два-три миллиметра клея к стенам над крышкой, чтобы сохранить раствор погружения. После этого протокола ткань мозга будет очищена.
Чистые срезы мозга были подготовлены с использованием этого протокола для визуализации популяций астроцитов и нейронов в области CA1 гиппокампа мыши. Все астроциты экспрессировали tdTomato, а возбуждающие нейроны экспрессировали H2B-GFP в своих ядрах. Камера, подготовленная для осветленной ткани, была оптимальной для визуализации под двухфотонным или конфокальным микроскопом.
Используя двухфотонный микроскоп, более 300 астроцитов наблюдались в очищенном участке области CA1 гиппокампа мыши. Астроциты гиппокампа в красных и пирамидальных клетках, соматы зеленого цвета были видимыми и толстыми, прозрачными тканями, представляющими пространственную близость между этими двумя типами клеток. С помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа аксональные пучки из возбуждающих нейронов были прослежены по всему полушарию.
Зеленые пучки были прослежены от спинного гиппокампа к супермальярным телам. Красные пучки были прослежены от мамиллярных тел к их происхождению в вентиляционном гиппокампе. Такие факторы, как температура, концентрации и время инкубации, повлияли на результат процедуры ясности.
Поэтому точность каждого шага протокола имеет жизненно важное значение для успеха достижения чистой ткани. Используя эту технику, мы измеряем расстояния между нейронами и астроцитами в нескольких структурах мозга. Этот протокол позволил проанализировать на два-три порядка больше клеток, чем в предыдущих исследованиях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании используется метод CLARITY в сочетании с трансдукцией вирусными векторами для изучения пространственных взаимоотношений между нейронами и астроцитами в гиппокампе мыши. Делая ткань прозрачной, эта методика позволяет исследователям изучать большее количество клеток, раскрывая особенности клеточной организации и взаимодействий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Методы просветления тканей
- Клеточная визуализация
Теоретические основы
- Метод CLARITY позволяет осуществлять визуализацию тканей мозга на клеточном уровне.
- Он обеспечивает возможность анализа больших популяций нейронов и астроцитов в интактных тканях.
- Данный метод повышает прозрачность толстых срезов мозга по сравнению с традиционными методами визуализации.
- В исследовании подчеркивается роль прозрачности тканей в понимании архитектуры нейронов.
Цель исследования
- Изучить структурные взаимосвязи между астроцитами и нейронами в гиппокампе мыши.
- Измерить расстояния между различными типами клеток в различных структурах мозга.
- Продемонстрировать эффективность метода CLARITY для визуализации клеток.
Используемые методы
- В исследовании для просветления срезов мозга использовался метод CLARITY.
- Для визуализации астроцитов и возбуждающих нейронов использовалась ткань гиппокампа мыши.
- Рабочие процессы мультиомики не упоминались.
- Основные этапы включали дегазацию, полимеризацию гидрогеля и инкубацию в растворах для просветления.
- Визуализация ткани проводилась с помощью двухфотонной и конфокальной микроскопии.
Основные результаты
- В просветленных срезах гиппокампа было визуализировано более 300 астроцитов.
- Был установлен пространственный контекст расположения астроцитов и возбуждающих нейронов, что позволило выявить их близость друг к другу.
- В просветленных тканях были отмечены значительные скопления аксональных пучков между популяциями нейронов.
- На прозрачность тканей влияли различные факторы, что подчеркивает необходимость использования точной методологии.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует, что метод CLARITY может значительно улучшить визуализацию клеточных взаимодействий в головном мозге.
- Полученные результаты позволяют лучше понять пространственную организацию нейронов и глиальных клеток.
- Данные, полученные с помощью этого метода, могут иметь важное значение для исследований нейрональных механизмов и потенциальных моделей заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Картирование пространственных взаимодействий между астроцитами и нейронами в интактной ткани мозга с высоким разрешением позволяет восполнить критический пробел в ранней валидации мишеней ЦНС и механистическом снижении рисков. Интеграция маркировки вирусными векторами с методом просветления тканей CLARITY обеспечивает количественный крупномасштабный анализ клеточных доменов, что повышает прогностическую достоверность нейробиологических открытий. Данная возможность оптимизирует отбор проектов в портфеле за счет предоставления надежных масштабируемых данных о взаимодействиях типов клеток, имеющих значение для моделирования заболеваний и приоритизации мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает количественный анализ пространственных взаимоотношений между астроцитами и нейронами в областях мозга, имеющих значение для патологии.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет уточнения границ клеточных доменов и показателей близости.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней с помощью генетически определенного маркирования и визуализации типов клеток.
- Предоставляет высококонтентные данные для повышения прогностической достоверности при выборе мишеней в ЦНС.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем из интактной ткани головного мозга для последующих анализов с использованием методов визуализации.
- Стандартизация подготовки образцов для получения воспроизводимых количественных пространственных измерений.
- Обеспечение масштабируемой визуализации от сотен до тысяч клеток на образец для проведения надежного скрининга.
- Поддержка разработки анализов для оценки соединений, воздействующих на нейрон-глиальные взаимодействия.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты пространственного картирования с релевантными моделями ЦНС для обеспечения трансляционной преемственности.
- Обеспечивает продвижение с учетом рисков за счет предоставления количественных показателей взаимодействий между типами клеток.
- Способствует поиску биомаркеров посредством картирования клеточных доменов с высоким разрешением.
- Обеспечивает преемственность процессов от этапа открытия до доклинической валидации в портфелях нейробиологических исследований.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая высокосодержательный пространственный анализ генетически определенных популяций клеток головного мозга.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о взаимодействии астроцитов и нейронов и проясняет механизмы путей в тканях ЦНС.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные о пространственном распределении для оценки готовности анализа и скрининга соединений.
- Аналитика: предоставляет показатели близости клеток и заполнения доменов для сравнительного анализа различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывает данные пространственного картирования с моделями заболеваний и стратегиями поиска биомаркеров при поддержке системы.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает масштабируемый, многократно используемый рабочий процесс для просветления и визуализации тканей ЦНС в рамках нескольких программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней в ЦНС.
- Операционная ценность: стандартизирует методы просветления тканей и визуализации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет получения надежных количественных данных.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению нейробиологических активов.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с трансдукцией вирусными векторами, просветлением тканей и передовыми методами микроскопии.
- Необходим доступ к платформам двухфотонной или конфокальной визуализации и аналитической инфраструктуре.
- Требуется строгая стандартизация протокола для обеспечения воспроизводимости результатов разными исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация методики для различных областей мозга или модельных систем.
- Точность выполнения протокола имеет решающее значение; температура, концентрация реагентов и временные интервалы напрямую влияют на качество данных.
