Визуализация подвижности бактерий на основе цветовой реакции
15 февраля 2022 г.
Здесь мы представляем протокол для обнаружения бактериальной подвижности, основанный на цветовой реакции. Ключевые преимущества этого метода заключаются в том, что он прост в оценке и более точен, и не требует специализированного оборудования.
Обнаружение подвижности бактерий важно, потому что подвижность имеет решающее значение для патогенности. Описанный здесь протокол является надежным методом выявления подвижности бактерий, поскольку в его основе лежит цветовая реакция ТТС с внутриклеточными дегидрогеназами живых бактерий. Метод определения подвижности бактерий с помощью полутвердого агара TTC прост, удобен в эксплуатации и не требует больших и дорогостоящих инструментов.
Метод может быть использован клиническими микробиологами или исследователями для изучения патогенных бактерий. Демонстрировать процедуру будет Сийи Чжуан, старший экспериментатор из моей лаборатории. Для начала приготовьте традиционную полутвердую среду, добавив 10 граммов триптозы, 15 граммов хлорида натрия и четыре грамма агара в достаточном объеме дистиллированной воды.
Отрегулируйте pH до 7,2 и составьте окончательный объем до 1 000 миллилитров. Автоклавируйте среду при температуре 121 градус Цельсия в течение 20 минут и раздайте среду по 10 миллилитровым пробиркам на высоту трех сантиметров. Для приготовления среды TTC охладите автоклавную традиционную среду до 50 градусов Цельсия, затем добавьте пять миллилитров стерильного 1%-ного раствора TTC на 100 миллилитров среды.
Смешайте и распределите среду по 10 миллилитровым пробиркам на высоту трех сантиметров. Соберите отдельные колонии бактерий из агаровых пластин и введите их в обе полутвердые среды путем прокола с помощью инокуляционных игл. Не забывайте включать немодальные деформации в качестве отрицательного контроля и модальные деформации в качестве положительного контроля.
Чтобы наблюдать влияние концентрации агара на подвижность бактерий, готовят полутвердые среды, содержащие различные концентрации агара, и заквашивают их путем прокола. Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия и наблюдайте за результатами через 24–48 часов инкубации. Если только линия прокола красная, охарактеризуйте бактерии как немодальные.
Если красный цвет распространяется наружу по линии прокола, характеризуйте бактерии как модальные. Бактериальная подвижность сравнивалась для различных штаммов на традиционных и полутвердых средах TTC и обобщалась в этой таблице. После культивирования в течение 24 часов на полутвердой среде TTC золотистый стафилококк показал рост по инокулированной линии.
В то время как Escherichia coli показала рост во всех направлениях вокруг инокулированной линии. Наибольшая подвижность Escherichia coli наблюдалась в полутвердой среде TTC, приготовленной с 0,3%агаром, в которой среда становилась почти полностью красной. В противоположность этому, площадь красной диффузии уменьшалась на 0,5% агара, а диффузия продлевалась с увеличением концентрации агара до 0,8%. Важно отрегулировать pH до 7,2 и охладить автоклавную среду до 50 градусов Цельсия перед посевом с помощью игл.
Бактерии должны быть инокулированы путем прокола в полутвердую среду, содержащую ТТС. Это прямой метод определения подвижности бактерий. Также можно косвенно обнаружить моторику с помощью электронного микроскопа и
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен надежный протокол определения подвижности бактерий, что имеет важное значение для понимания патогенности. Метод основан на цветовой реакции TTC с внутриклеточными дегидрогеназами живых бактерий и представляет собой простой и точный подход, требующий минимального набора оборудования.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Подвижность бактерий и ее значение для патогенности
- Клиническая микробиология и методологии исследований
- Колориметрические методы обнаружения микроорганизмов
Теоретические сведения
- Значение подвижности бактерий при заболеваниях
- Существующие методы определения подвижности и их ограничения
- Необходимость в надежном и доступном методе
Используемые методы
- Метод полужидкого агара с ТТК
- Различные бактериальные штаммы, включая Staphylococcus aureus и Escherichia coli
- Колориметрическая оценка подвижности
Основные результаты
- Staphylococcus aureus демонстрирует рост вдоль линии прокола, что указывает на ограниченную подвижность
- Escherichia coli показала интенсивный рост, что свидетельствует о более высокой подвижности в среде с TTC
- Данный метод эффективно дифференцирует подвижные и неподвижные бактерии
Выводы
- В данном исследовании продемонстрирован простой метод оценки бактериальной подвижности, имеющий критическое значение для изучения патогенов.
- Доступность данного протокола делает его ценным как для клинических, так и для исследовательских условий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежное определение подвижности бактерий имеет важное значение для понимания механизмов патогенности, образования биопленок и лекарственной устойчивости на ранних этапах поиска новых противоинфекционных средств. Колориметрический анализ на основе TTC позволяет проводить стандартизированную количественную оценку фенотипов подвижности, обеспечивая прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении механистических рисков. Этот метод дает доступные и воспроизводимые результаты, которые служат основой для отбора перспективных направлений и обоснованного продвижения разработок в области инфекционных заболеваний с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональный анализ подвижности как фактора вирулентности патогенных бактерий.
- Способствует биологическому снижению рисков путем разграничения модальных и немодальных штаммов в определенных условиях.
- Обеспечивает получение количественных, воспроизводимых фенотипических данных для валидации мишеней и механистических исследований.
Скрининг и разработка методов анализа
- Облегчает подготовку валидированных тестов на подвижность для рабочих процессов скрининга соединений.
- Обеспечивает стандартизированные колориметрические результаты, которые легко интерпретировать и сравнивать между экспериментами.
- Позволяет масштабируемо развертывать тесты с минимальной инфраструктурой для обеспечения готовности к высокопроизводительному скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласует фенотипирование подвижности с поведением бактерий, имеющим значение для заболевания, для обеспечения трансляционной непрерывности.
- Поддерживает принятие решений о продвижении с учетом рисков путем установления связи между подвижностью in vitro и потенциальной патогенностью in vivo.
- Предоставляет платформу для оценки влияния переменных окружающей среды на фенотипы подвижности.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный тест подвижности на основе ТТК подходит для этапа от раннего поиска до идентификации ведущих соединений, обеспечивая надежный фенотипический скрининг и валидацию мишеней для портфелей противоинфекционных препаратов.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о патогенных механизмах, обусловленных подвижностью, и уточнение сигнальных путей.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные колориметрические результаты для стандартизации анализа и оценки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить прямое сравнение фенотипов подвижности различных штаммов и условий, используя измеряемые паттерны диффузии.
- Трансляционные исследования: связывает данные о подвижности in vitro с поведением бактерий, имеющим значение для заболевания, при наличии подтверждения в последующих моделях.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет многоразовую недорогую платформу для оценки подвижности различных видов бактерий и исследовательских программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при валидации мишеней и снижает механистическую неопределенность при поиске противоинфекционных средств.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые анализы подвижности без необходимости использования специализированного оборудования.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет возможности раннего снижения фенотипических рисков.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение кандидатов в противоинфекционные препараты на основе функциональных данных о подвижности.
Особенности реализации
- Требуются базовые микробиологические знания для постановки анализа и интерпретации результатов.
- Минимальные требования к оборудованию: необходимы только стандартные инкубаторы и основные лабораторные расходные материалы.
- Стандартизация концентрации агара, pH и условий инкубации имеет решающее значение для воспроизводимости.
- Метод применим для широкого спектра видов бактерий и различных условий окружающей среды.
- Потенциальные ограничения включают чувствительность к условиям роста и необходимость использования живых, метаболически активных бактерий.
