Обнаружение и количественное определение клеток, удерживающих метки, в резцах мышей с использованием подхода 3D-реконструкции после очистки тканей
10 июня 2022 г.
Резец мыши содержит ценные клетки, удерживающие метки, в нише стволовых клеток. У нас есть новый способ объективного обнаружения и количественной оценки клеток, удерживающих метки; в нашем исследовании использовалась маркировка EdU и подход к 3D-реконструкции после очистки ткани нижней челюсти PEGASOS.
Этот протокол описывает метод in vivo и трехмерной визуализации и количественного определения клеток, удерживающих метки, ниши стволовых клеток резцов мыши. Этот метод экономит время и удобен для новых учеников. 3D-изображения получаются без повреждения тканей.
Количественная 3D-оценка делает данные более надежными и точными. Для начала препарируйте нижние челюсти. Зафиксируйте образцы в 4% параформальдегиде и держите их при комнатной температуре в течение ночи.
После инкубации удалите мышцы с челюстей. Погрузите их в 0,5-молярный раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты для удаления накипи в течение четырех дней с ежедневной сменой среды на шейкере с температурой 37 градусов Цельсия. Обесцвечивайте мандибулы в 15 миллилитрах 25% раствора квадрола на шейкере при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного дня, чтобы удалить оставшийся гем крови.
Для окрашивания 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина приготовьте свежий коктейль с маркировкой 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина, как указано в тексте. Промойте нижние челюсти фосфатно-буферным физиологическим раствором с Tween 20 или PBST в течение 30 минут на шейкере с температурой 37 градусов по Цельсию. Повторите промывку челюстей фосфатно-буферным физиологическим раствором трижды в течение трех минут каждая, а затем инкубацию в свежеприготовленном коктейле с маркировкой 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина на шейкере в течение ночи.
Повторите промывку фосфатно-солевым раствором три раза и выполните последовательную делипидизацию, поместив мандибулы в растворы, упомянутые в тексте, на шесть часов каждый в шейкер с температурой 37 градусов Цельсия. Обезвоживайте мандибулы в растворе трет-бутанола-полиэтиленгликоля или tB-PEG в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия с суточной сменой среды. Через два дня очистите нижнюю челюсть в среде для очистки бензилбензоата-полиэтиленгликоля, содержащей 75% бензилбензоата, 22% полиэтиленгликоля-метилэфира метакрилата в среднем 500 или ПЭГ-ММА500 и 3% квадрола, чтобы получить соответствие показателя преломления и до достижения прозрачности.
Установите очищенную от ткани всю нижнюю челюсть на предметные стекла полости марки в среде для очистки бензилбензоата и полиэтиленгликоля и накройте ее предметными стеклами. В программном обеспечении для конфокальной визуализации установите желаемые параметры получения изображения. В панели флуоресцентного возбуждения активируйте лазер, необходимый для оптимального возбуждения флуорофоров.
На панели для обнаружения флуоресценции переместите ползунок, чтобы выбрать длины волн для измерения. Добавьте каплю иммерсионного масла с показателем преломления 1,52 поверх покровного стекла, чтобы оно соответствовало показателю преломления стеклянного покровного стекла и объектива, и поместите установленную нижнюю челюсть на столик микроскопа. Включите люминесцентные лампы и выберите подходящий объектив увеличения для интересующих областей изображения.
В режиме сканирования в реальном времени определите поле зрения, чтобы визуализировать всю область нижней челюсти в измерениях X и Y. Установите верхнюю и нижнюю ступени Z-ступени, которые точно покрывают объем ниши стволовых клеток в резце мышей. Используйте размер шага Z в два микрометра или в соответствии с вашими требованиями.
Получение и сохранение файлов изображений Z-stack в формате LIF. Используйте конвертер файлов программного обеспечения для обработки изображений, чтобы преобразовать файл изображения Z-stack в файл собственного формата. В программном обеспечении для обработки изображений нажмите кнопку «Арена», затем выберите «Изображение».
Выберите исходный файл lif и выберите объединенный файл. Изображения будут импортированы в программное обеспечение для обработки изображений. Дважды щелкните импортированный файл, чтобы открыть набор данных изображения.
В программном обеспечении для обработки изображений посетите панель «Регулировка дисплея». На панели «Настройка дисплея» нажмите на название канала. Обычно он помечен красным цветом в режиме по умолчанию.
В окне «Свойства изображения» перейдите на вкладку «Сопоставленный цвет». В параметре «Файл вкладки цвета» выберите «Огненный поток» и нажмите «ОК». Выберите цвет дисплея, чтобы отличить фоновую флуоресценцию и положительную флуоресценцию от образца. В левом верхнем углу экрана на панели «Свойства сцены» нажмите на синий значок с надписью «Добавить новую поверхность».
Снимите флажок «Громкость», чтобы удалить большую часть фоновой флуоресценции, в результате чего положительная флуоресценция будет отчетливо видна при ручной сегментации. Далее запустите ручную сегментацию интересующего региона, или ROI, нажав на вкладку «Создать» и выбрав вкладку «Пропустить автоматическое создание, редактировать вручную». В мастере ручного создания поверхности щелкните вкладку «Контур», чтобы выбрать ориентацию на основе образцов, чтобы легко определить рентабельность инвестиций.
Затем убедитесь, что меню указателя в правом углу находится в режиме выбора. Отрегулируйте положение среза, чтобы найти ROI в ткани. Как упоминалось ранее, большая часть фоновой флуоресценции уже удалена.
Нажмите кнопку «Нарисовать» и нарисуйте ориентировочную область интереса. Выберите для параметра «Видимость» значение «Нет», чтобы избежать помех из других областей, кроме ROI, а затем сегментируйте интересующую область срез за срезом. После завершения чертежа ROI нажмите «Создать поверхность», чтобы получить 3D-геометрию ROI.
Нажмите кнопку «Изменить» в мастере ручного создания поверхностей и выберите «Маскировать все». В появившемся окне «Канал маски» выберите «Канал 1» в параметрах «Выбор канала». После этого выберите «Дублировать канал» перед применением маски.
В настройках маски выберите Константа внутри/снаружи и установите воксельную внешнюю поверхность на ноль. В области «Свойства сцены» снимите флажок с объекта Surface и выберите объект «Объем». В разделе «Настройка дисплея» отмените выбор исходного красного канала и выберите красный канал в маске.
И отрегулируйте интенсивность цвета, чтобы получить желаемую рентабельность инвестиций в флуоресценцию с 3D-визуализацией и положительной маркировкой. Создайте новый точечный объект, щелкнув значок «Пятна», чтобы количественно оценить ячейки с сохранением меток в 3D-рендеринге путем создания 3D-точек, которые сопоставимо перекрываются с ячейками, сохраняющими метки в 3D-визуализации. Используйте нижние стрелки для перемещения между шагами в мастере создания точек.
Нажмите кнопку «Готово» и выберите кнопку «Статистика». Затем выберите вкладку «Общие», чтобы найти значение общего количества пятен на изображении. После мечения 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина и процесса очистки тканей системы растворителей, связанного с полиэтиленгликолем, была получена прозрачная нижняя челюсть.
Модифицированный образец сравнивали с нормальной нижней челюстью без процесса очистки тканей, а прозрачную нижнюю челюсть с 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридин-мечением подвергали конфокальной визуализации. Оптический срез резца показал клетки, удерживающие метки, в нише стволовых клеток верхушки резца в плоскости XY. Конструкция 3D-изображения верхушки резца показала 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридин, сохраняющие положительную метку, спокойные стволовые клетки как в эпителиальной, так и в мезенхимальной нише стволовых клеток.
Положительные клетки 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина были перенесены в пятна для количественного определения, которые сравнительно перекрывались с клетками, удерживающими мезенхимальные метки. На изображении видны пятна, созданные только для мезенхимальных клеток, удерживающих метки, и только для эпителиальных клеток, удерживающих метки. Также было проведено количественное определение эпителиальных и мезенхимальных клеток, удерживающих метки.
Свойства обработки и очистки являются наиболее важными этапами и должны быть оптимизированы в соответствии с использованием ткани для получения удовлетворительных результатов. Этот метод также может быть модифицирован для визуализации LRC уровня S2VGFP и отслеживания клеточных линий для получения подробной информации о местонахождении потомства и их количественном определении или вкладе.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод визуализации и количественного определения клеток, удерживающих метку, в нише стволовых клеток резца мыши in vivo. Благодаря использованию маркирования EdU и метода 3D-реконструкции после просветления тканей PEGASOS, данный подход повышает надежность и точность сбора данных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Исследование стволовых клеток
- Методы 3D-визуализации
Теоретические сведения
- Клетки, сохраняющие метку, имеют решающее значение для понимания ниш стволовых клеток.
- Резец мыши служит моделью для изучения этих клеток.
- Традиционные методы могут не обеспечивать точного количественного анализа.
- Прояснение тканей методом PEGASOS позволяет лучше визуализировать клеточные структуры.
Цель исследования
- Разработать удобный метод количественного определения клеток, сохранивших метку.
- Повысить точность 3D-визуализации биологических образцов.
- Способствовать проведению исследований в области биологии стволовых клеток и регенерации тканей.
Используемые методы
- Диссекция нижних челюстей мыши.
- Фиксация в 4% параформальдегиде при комнатной температуре в течение ночи.
- Маркировка EdU для идентификации клеток, удерживающих метку.
- 3D-реконструкция с использованием метода просветления тканей PEGASOS.
Основные результаты
- Успешная визуализация клеток, удерживающих метку, в 3D.
- Количественная оценка клеток продемонстрировала повышенную точность.
- Метод оказался экономичным по времени и удобным в использовании.
- Полученные данные позволяют проводить дальнейшие исследования ниш стволовых клеток.
Выводы
- Новый метод расширяет возможности изучения клеток, удерживающих метку.
- 3D-визуализация предоставляет ценные сведения о биологии стволовых клеток.
- Данный метод может быть внедрен исследователями в этой области.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественная 3D-визуализация клеток, удерживающих метку (LRCs), в резцах мыши позволяет с высокой степенью достоверности исследовать гомеостаз и обновление взрослых стволовых клеток. Этот подход повышает точность прогнозирования динамики ниши стволовых клеток, что способствует раннему обнаружению и механическому снижению рисков для портфелей в области регенеративной медицины и тканевой инженерии. Непредвзятость количественного анализа и воспроизводимость данного метода делают его стратегическим активом для трансляционных исследований и разработки доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность прямого количественного анализа покоящихся популяций стволовых клеток для проверки гипотез при валидации мишеней.
- Поддерживает снижение механистических рисков за счет разграничения вклада эпителиальных и мезенхимальных стволовых клеток.
- Способствует приоритизации портфеля проектов путем предоставления надежных и воспроизводимых данных о нишах стволовых клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные трехмерные (3D) биологические системы для последующих этапов скрининга.
- Обеспечивает получение стандартизированных количественных данных для воспроизводимости анализа и сопоставимости результатов различных исследований.
- Позволяет надежно оценивать влияние соединений на поддержание и дифференцировку стволовых клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний, актуальным для изучения регенерации тканей и динамики стволовых клеток.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить отслеживание клеточных линий и количественную оценку потомства.
- Поддерживает принятие обоснованных решений о продвижении проектов в области регенеративной медицины и тканевой инженерии с учетом рисков.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод количественного анализа LRC в 3D объединяет этапы от раннего поиска до доклинических исследований, связывая проверку гипотез, валидацию мишеней и разработку трансляционных моделей.
- Фундаментальная биология: поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей при гомеостазе стволовых клеток.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые результаты 3D-визуализации, готовые для проведения анализа при оценке соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных для достоверного статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: обеспечивает согласованность биомаркеров и преемственность между этапами фундаментальных исследований и доклинических испытаний.
- Корпоративное повторное использование: предлагает многократно используемую платформу для количественного анализа стволовых клеток и отслеживания линий клеток в рамках нескольких программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях стволовых клеток.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы 3D-количественного анализа и визуализации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления надежных количественных данных.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков и продвигать активы в области регенеративной медицины и тканевой инженерии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами просветления тканей, конфокальной микроскопией и 3D-анализом изображений.
- Необходим доступ к современному оборудованию для визуализации и совместимому аналитическому программному обеспечению.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и количественного анализа.
- Метод адаптируемы для различных типов тканей и задач по отслеживанию клеточных линий при условии оптимизации протокола.
- Результат зависит от оптимизации этапов просветления и обработки для конкретных типов тканей.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Tissue Clearing of Mandible Using PEGASOS Technique
3:03
Confocal Imaging of Tissue-Cleared Mandible
4:37
Image Processing, 3D Image Reconstruction, and Quantification of Label-Retaining Cells
8:25
Results: Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors
9:50
Conclusion
