Name: Липидомика тканей грызунов (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Изучите метод масс-спектрометрии для количественной липидомики тканей грызунов. Этот протокол позволяет профилировать более 400 молекулярных липидов в 14 классах и выявлять ранние биомаркеры токсичности.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы хотели бы поблагодарить исследовательскую группу и особенно отметить техническую помощь и поддержку групп биоисследований и аэрозолей в PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Сингапур, и PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Невшатель, Швейцария. Авторы благодарят Сэма Ансари за управление биобанкингом и выражают признательность за поддержку Синдхуре Бхаргави Гопале Редди за редактирование черновика рукописи.

Все авторы являются сотрудниками компании «Филип Моррис Интернэшнл». Компания «Филип Моррис Интернэшнл» является единственным источником финансирования и спонсором этого проекта.

Сигаретный дым (КС) признан основным фактором риска, связанным с развитием хронических воспалительных заболеваний легких, включая карциному легких, бронхит и хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ)1. Помимо воздействия на легкие, воздействие КС играет важную роль в развитии других заболеваний, таких как атеросклеротическая ишемическая болезнь сердца и заболевание периферических сосудов1. Сердечно-сосудистые заболевания, наряду с ХОБЛ, являются первой и третьей по значимости причинами смерти во всем мире, соответственно. Подходы к оценке токсикологического риска исторически основывались на использовании моделей животных, таких как грызуны. Модели крыс и мышей in vivo, предназначенные только для носа или всего тела, обычно используются для изучения долгосрочных последствий воздействия CS.
Например, как правило, 6 месяцев воздействия дыма вызывают гистологические и функциональные нарушения в легких мышей, которые имитируют нарушения заболевания человека, включая эмфизему, ремоделирование дыхательных путей и легочную гипертензию, хотя изменения относительно мягкие по сравнению с теми, которые наблюдаются у длительно курильщиков2. Как в тканях животных, так и в тканях человека в исследованиях наблюдался широкий спектр молекулярных изменений в ответ на воздействие CS, включая реакции окислительного стресса, воспаление и структурные изменения тканей 3,4. Неудивительно, что воздействие CS также оказывает далеко идущее влияние на липидом легких, включая воздействие на липиды сурфактанта, липидные сигнальные медиаторы и структурные липиды 4,5,6.
Чтобы охарактеризовать объемные изменения липидов, вызванные длительным воздействием CS на легкие мышей, мы провели быстрый и количественный масс-спектрометрический анализ прямой инфузии дробовика. После введения метода липидомики дробовика в 2005году 7 этот метод был эффективно использован для расширения наших знаний о липидном клеточном метаболизме 8,9,10 в модельных системах, таких как дрожжи 11, Caenorhabditis elegans12 и Drosophila melanogaster13, а также в широком диапазоне типов образцов млекопитающих, таких как клеточные линии 14, 15,16 различные ткани человека17,18 и грызунов19,20 и биологические жидкости21,22.
За последние десятилетия исследования выявили сложность клеточных реакций на изменения окружающей среды, включая тысячи взаимосвязанных белков, липидов и метаболитов. Это ясно дало понять, что использование современных аналитических методов имеет важное значение для получения углубленного представления о молекулярных механизмах и для раскрытия полной величины экзогенных физиологических воздействий. В этом контексте всеобъемлющие количественные липидные отпечатки, полученные с помощью подходов к липидомике, могут эффективно дополнить наши знания о липидном клеточном метаболизме 8,9,10.
Что касается воздействия CS как фактора риска для ряда заболеваний, токсикологические подходы к оценке риска исторически основывались на использовании моделей животных, таких как грызуны. Дробовик липидомики МС предоставляет быстрый, чувствительный и количественный аналитический инструмент для оценки возмущения липидома в различных типах образцов. Уникальной особенностью липидомики дробовика является автоматизированный анализ с прямой инъекцией общего липидного экстракта с добавлением меченых внутренних стандартов без хроматографического разделения в прибор MS с высоким разрешением с использованием проводящего наночипа, генерирующего наноспрей с ионизацией электрораспылением (ESI)23.
Информация об отношении массы к заряду, которая одновременно получается в режиме MS1, обеспечивает общий липидный след всех интактных эндогенных липидов. Опционально режим MS2/MS3, в котором родительские липидные молекулы фрагментируются и анализируются, предоставляет дополнительную структурную информацию. Анализ данных требует специализированного программного обеспечения и включает в себя деконволюцию спектров и присвоение пиков в объединенных спектрах, что приводит к идентификации липидов и выяснению предполагаемой химической структуры. Кроме того, абсолютное количественное определение может быть выполнено путем добавления меченой смеси внутренних стандартов, содержащей, по меньшей мере, один липидный стандарт для каждого интересующего класса липидов. В целом, с помощью данной методики анализ РС, занимающий несколько минут на образец, может охватывать идентификацию и количественное определение до 800 липидов из 14 классовлипидов 24 в тканях грызунов.

<table><tbody><tr><td>1, 5 и 2 мл самоблокирующиеся трубки</td><td>Eppendorf</td><td>30120086, 30120094</td><td></td></tr><tr><td>3 мм нержавеющие штачки</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>4.1 & micro; m сопловая стружка</td><td>Advion</td><td>HD-D-384</td><td></td></tr><tr><td>Уксусная кислота</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45754-100ML-F Ацетат</td><td></td></tr><tr><td>аммония</td><td>Honeywell</td><td>14267-25G</td><td></td></tr><tr><td>Бикарбонат аммония</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>Бычья сыворотка альбумин стандартная, 2 мг/мл</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 23209</td><td></td></tr><tr><td>Бутанол</td><td>Honeywell</td><td>33065-2,5L</td><td></td></tr><tr><td>Хлороформ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650498-1L</td><td></td></tr><tr><td>Дихлорметан</td><td>Honeywell</td><td>34856-1L</td><td></td></tr><tr><td>Этилацетат</td><td>Honeywell</td><td>33211</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 луночные пластины</td><td>Sigma</td><td>M9686</td><td></td></tr><tr><td>Гептан</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34873-2,5L</td><td></td></tr><tr><td>Изопропанол</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461</td><td></td></tr><tr><td>Метанол</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Мышь пул плазмы</td><td>BioIvt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse SPLASH стандарт</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>330710X</td><td>Внутренний стандарт</td></tr><tr><td>Nunc 96-плоское дно хорошо прозрачные пластины</td><td>VWR</td><td>62409-068</td><td></td></tr><tr><td>Пластиковый шпатель</td><td>Sigma</td><td>Z560049-300EA</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford 1x Краситель реагент</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Сыворотка разбавитель</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5197</td><td></td></tr><tr><td>Оборудование/программное обеспечение</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoPrep CP02 ударный инструмент</td><td>Covaris</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Магнитный молоток</td></tr><tr><td>Центрифуга 5427R</td><td>Eppendorf</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>центрифуга</td></tr><tr><td>ЧипСофт 8.3</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Программное обеспечение для настройки метода и сбора данных на роботе Triversa nanomate</td></tr><tr><td>LipidXplorer 1.2.8.1</td><td>N/A</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Программное обеспечение для определения липидов</td></tr><tr><td>Пик за пиком</td><td>SpectroSwiss</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Программы для конвертации данных .raw из MS в формат .mzml</td></tr><tr><td>ProteoWizard</td><td>ProteoWizard</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Альтернативное (с открытым исходным кодом) программное обеспечение для преобразования данных .raw из MS в формат .mzml</td></tr><tr><td>Q-Exactive MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Масс-спектрометр с высоким разрешением orbitrap</td></tr><tr><td>Qiagen Тканевый Лизер II</td><td>Qiagen</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Лизер для тканей</td></tr><tr><td>SpeedVac SPD140DDA</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Вакуумный концентратор</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M nano plus</td><td>Tecan</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Считыватель пластин</td></tr><tr><td>Термомиксер C</td><td>Eppendorf</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Термомиксер</td></tr><tr><td>TriVersa Nanomate</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Наноисточник прямой инфузии</td></tr><tr><td>Xcalibur 4.3</td><td>Thermo Scientific</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Программное обеспечение для настройки метода и сбора данных на Q-Exactive MS</td></tr></tbody></table>

Липидомика тканей грызунов

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Липиды играют жизненно важную роль в качестве основных компонентов всех прокариотических и эукариотических клеток. Постоянные технологические усовершенствования в масс-спектрометрии сделали липидомику мощным аналитическим инструментом для мониторинга липидомных составов тканей как при гомеостатических состояниях, так и при болезненных состояниях. В этой статье представлен пошаговый протокол для метода анализа липидов дробовика, который поддерживает одновременное обнаружение и количественное определение нескольких сотен молекулярных видов липидов в различных образцах тканей и биожидкостей с высокой пропускной способностью. В этом методе используется автоматизированная нанопоточная прямая инъекция общего липидного экстракта, снабженного мечеными внутренними стандартами, без хроматографического разделения в масс-спектрометрический прибор высокого разрешения. Начиная с субмикрограммового количества ткани грызунов, анализ рассеянного склероза занимает 10 минут на образец и охватывает до 400 липидов из 14 классов липидов в легочной ткани мыши. Представленный здесь метод хорошо подходит для изучения механизмов заболевания, а также для выявления и количественного определения биомаркеров, которые указывают на раннюю токсичность или благотворное воздействие на ткани грызунов.

Здесь, в качестве репрезентативных результатов, мы представляем данные, иллюстрирующие, как липидомика дробовика может быть использована для изучения влияния CS на легкие мышей. Протокол анализа липидов дробовика был успешно применен для исследования in vivo для сравнительного анализа двух групп образцов: тканей легких, рассеченных у девяти самок мышей Apoe-/-, подвергшихся воздействию CS (группа 3R4F; положительный контроль), и равного количества мышей, содержащихся в условиях свежего воздуха (фиктивная группа) в качестве отрицательного контроля, собранного через 3 месяца, 4 месяца и 6 месяцев времени воздействия. Животные содержались под фильтрованным и кондиционированным свежим воздухом при температуре 22 °C ± 2 °C и влажности 55% ± 15% и питались гранулированным диетой с гамма-облучением. Световой режим поддерживался на уровне 12 ч в сутки. В каждой клетке содержалось до восьми мышей. Эталонные сигареты 3R4F для обработки воздействия были приобретены в Университете Кентукки для получения аэрозоля 3R4F CS (600 мкг общего аэрозоля твердых частиц TPM/L) для целевой концентрации воздействия, эквивалентной 28 мкг никотина/л.CS дым от сигарет 3R4F производился с использованием 30-портовых ротационных коптильных машин, согласно Phillips et al.27 . В соответствии с Протоколом интенсивного курения Министерства здравоохранения Канады к сигаретам 3R4F применялось 55 мл объема затяжки, одна затяжка в 30 с и 100% закупорка вентиляционных отверстий, чтобы обеспечить достаточное воздействие. Все дополнительные подробности о дизайне исследования были сообщены ранее27,28.
В целом, ~ 400 молекулярных видов липидов из 14 наиболее распространенных классов липидов были идентифицированы и количественно оценены (рис. 3). Общая нормализованная концентрация липидов по классу была немного повышена для классов липидов PE, PEO, PC, PCO, PI и PG, и некоторое снижение наблюдалось для липидов SM, LPE и PA (рис. 3A), в то время как для TAG и PS различий не наблюдалось. Интересно, что повышенные уровни липидов плазмалогена PCO и PEO в группе CS были зарегистрированы в воспалительных клетках29 . Одной из внутриклеточных функций липидов плазмалогена является антиоксидантная активность. При воздействии активных форм кислорода (АФК) и азота (РНС) сообщалось о селективном окислении плазмалогенов по сравнению с диацилфосфолипидами30. Связь с енил-эфиром в химической структуре плазмалогенов чувствительна к радикальной атаке на окислительный стресс31. Основными продуктами радикальной атаки являются гидроксилированные эйкозатетраеновые кислоты, фосфолипиды 2-моноацилглицерина, пентадеканол, муравьиные кислоты, α-гидроксиальдегиды различной длины цепи, 1-формил-2-арахидоноилглицерофосфолипиды и лизофосфолипиды.
Эти результаты показывают, что среди молекулярных особенностей, основанных на общей молекулярной формуле, воздействие CS значительно повлияло на 100-120 соединений (рис. 3D). Детальная деконволюция информации о фрагментации MS2 и нормализация интенсивности сигнала фрагмента позволили приблизительно определить общее количество каждой конъюгированной жирной кислоты (ЖК), представленной в каждом классе липидов (рис. 3E), и сравнить эти данные между группами, подвергшимися воздействию, и контрольной группой. Наблюдалось явное снижение как полностью насыщенных ЖК, так и ненасыщенных ЖК, в основном в контексте лизолипидов. Напротив, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) в составе классов фосфолипидов PC, PE и PG были повышены в группе CS для всех временных моментов. Крайние случаи ПК и ПГ, конъюгированные с эйкозапентановой (ЭПК) и докозагексаеновой кислотой (ДГК), были обнаружены исключительно в группе воздействия 3R4F CS (рис. 3E, красный цвет).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Рисунок 1: Расположение планшета для распределения образцов в анализе Брэдфорда. Заготовки и стандартные образцы размещаются в трех экземплярах в графах 1-3; Неизвестные образцы помещаются в двух экземплярах в графах 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Рисунок 2: Расположение 96-луночного микротитровального планшета для масс-спектрометрического анализа дробовика. Распределение холостых, стандартных, неизвестных и КК образцов для сбора в режиме положительной ионизации отображено на левой стороне планшета (столбцы 1-6); Все образцы для режима отрицательной ионизации размещены справа (столбцы 7-12). Сокращения: pos = положительный; QC = контроль качества; neg = отрицательный; TB = общее пустое. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Рисунок 3: Анализ липидомики легких мышей, подвергшихся воздействию сигаретного дыма. Мыши Apoe-/− подвергались воздействию CS от эталонной сигареты 3R4F или свежего воздуха (фиктивный). А) Концентрации в классе липидов и количество видов липидов в каждом классе. Для каждого класса в скобках указано количество количественных видов липидов. Средние и 95% доверительные интервалы для каждого класса липидов, отдельно для каждого типа воздействия (агрегированные по трем временным точкам). (B) Графики вулканов, показывающие величину эффекта (изменение log2 раза) и значимость (значение p с поправкой на -log10 FDR) количественных видов липидов для сравнения 3R4F CS и фиктивного в три момента времени. Значительно повышенные липиды отмечены желтым цветом; значительно сниженные липиды отмечены в голубом цвете (скорректированное FDR значение p &lt; 0,05). (C) Дифференциальная численность 25 видов липидов с наибольшими абсолютными средними изменениями складок. Изменения log2 fold для сравнения 3R4F CS и фиктивного сравнения имеют цветовую кодировку, и указывается статистическая значимость: *: значение p с поправкой на FDR &lt; 0,01; X: значение p с поправкой на FDR &lt; 0,05. (D) Сравнительные графики. Коэффициенты корреляции для сравнений с кратным изменением имеют цветовую кодировку, и указывается количество общих дифференциально распространенных липидов (общие числа на полях). Круговые диаграммы показывают процент общих дифференциально распространенных липидов с одинаковым направлением изменения (знак FC). Звездочка указывает на значительное перекрытие дифференциально обильных липидов. (E) Дифференцированное содержание конъюгированных ЖК по классу липидов. Тепловая карта, как показано на панели C , для конъюгированных жирных кислот со значительными различиями в численности между 3R4F и фиктивным воздействием во всех трех временных точках (скорректированное FDR значение p &lt; 0,05). Количество каждой жирной кислоты на класс липидов оценивали на основе интенсивности MS2 фрагментов жирных кислот. Сокращения: CS = сигаретный дым; FDR = частота ложных обнаружений; FC = изменение крата; FA = жирные кислоты; ПК = фосфатидилхолин; PS = фосфатидилсерин; TAG = триацилглицерин; SM = сфингомиелин; ПЭО = плазмалоген фосфатидилэтаноламин; ПЭ = фосфатидилэтаноламин; PG = фосфатидилглицерин; PI = фосфатидилинозитол; DAG = диацилглицерин; SE = эфиры стерина/холестерина; PCO = плазмалоген фосфатидилхолин; ЛПК = лизофосфатидилхолин; LPE = лизофосфатидилэтаноламин; PA = фосфатидная кислота. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Конечная концентрация БСА (мг/мл)</td>
			<td>Раствор BSA в дозе 2 мг/мл (мкл)</td>
			<td>Буфер на основе бикарбоната аммония (мкл)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 раствора 0,125 мг/мл</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Схема разбавления внутреннего стандарта BSA для калибровочной кривой для анализа Брэдфорда. Аббревиатура: BSA = бычий сывороточный альбумин.
Дополнительная информация: Файлы MFQL, используемые для идентификации липидов LipidXplorer. Пакет .zip состоит из отдельных обязательных файлов MFQL, каждый из которых именуется следующим образом: &lt;аббревиатура класса липидов&gt;_&lt;режим ионизации&gt;_MS2.mfql (например, PE_neg_MS2.mfql). Имена файлов для маркированной внутренней стандартной идентификации включают тег D7 (D9) в &lt;аббревиатуру липидов&gt; (например, PED7_neg_MS2.mfql). Эти файлы MFQL используются для проверки количества дейтерия во внутреннем стандарте. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Липидомика на основе масс-спектрометрии дробовика обеспечивает чувствительный количественный снимок широкого спектра классов липидов одновременно в одном измерении из различных тканей грызунов.

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Представленный протокол позволяет количественно оценить широкий спектр липидов в тканях животных. Это простой инструмент для изучения липидных механизмов, а также для выявления биомаркеров, указывающих на раннюю токсичность на животных моделях. Метод обеспечивает количественный профиль более 400 молекулярных липидов в 14 различных классах липидов в широком спектре матриц образцов с 10-минутным временем тренда на образец.Для начала разбавьте надосадочную жидкость центрифугой аликвот 1 в два раза больше концентрации буфером из бикарбоната аммония. После приготовления стандартной кривой бычьего сывороточного альбумина переверните стандартные пробирки и центрифугируйте пробирки при 18, 200 г в течение 15 секунд при комнатной температуре. Из стандартных пробирок, подготовленных ранее, перенесите по 6 микролитров каждой заготовки, стандартов и образцов на 96-луночную пластину с плоским дном.Затем добавьте 250 микролитров реагента Брэдфорда в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки и перемешайте. После инкубации в течение 5 минут измерьте поглощение на длине волны 595 нанометров с помощью планшетного считывателя. Подготовьте 2 миллилитровые пробирки со 100 микролитрами раствора бикарбоната аммония в каждую пробирку общей заготовки и внутренней стандартной заготовки и храните все образцы на льду.Подготовьте образцы контроля качества, учитывая, что один образец контроля качества помещается между каждым набором из 10 образцов. Добавьте 10 микролитров объединенной человеческой плазмы в 2-миллилитровые пробирки, затем добавьте 10 микролитров внутреннего стандартного раствора во все внутренние стандартные заготовки, образцы контроля качества и исследования. Добавьте 300 микролитров смеси бутанола и метанола минус 20 градусов Цельсия к каждому образцу и взбалтывайте при 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре на термомиксе.Затем добавьте 300 микролитров смеси гептана этилацетата и взбалтывайте при 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре на термомиксере, затем добавьте 300 микролитров 1%-ной смеси аскетической кислоты и взбалтывайте в течение 5 минут при 450 г при комнатной температуре на термомиксере. Центрифугу при 2 800 г в течение 5 минут при комнатной температуре и перелить 360 микролитров верхней фазы в новую 2-миллилитровую самоблокирующуюся пробирку с маркировкой 2. После добавления 320 микролитров гептанэтилацетата в пробирку водной фазы, помеченную как 1, встряхните при 450 г в течение 5 минут при комнатной температуре на термомиксере, затем центрифугу при 2 800 г в течение 5 минут при комнатной температуре, как показано ранее.Перенесите 320 микролитров верхней фазы и соедините их с фракцией из предыдущего шага в пробирку 2. Аналогичным образом добавьте 250 микролитров гептанэтилацетата в водную фазу в пробирке 1 и встряхните при 450 г в течение 5 минут при комнатной температуре на термомиксере. Снова центрифугу при 2 800 г в течение 5 минут при комнатной температуре, затем переносят 200 микролитров верхней фазы и соединяют ее с фракциями из предыдущих этапов в пробирке 2.Выпарить досуха при 35 градусах Цельсия в вакуумном концентраторе и повторно растворить в 300 микролитрах раствора смеси МС. Встряхните каждую пробирку в течение 5 секунд, чтобы убедиться, что все растворилось, и центрифугу при 18, 200 г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Перенесите аликвоту 50 мкл в микролитровую пластину для анализа режима положительной ионизации и разбавьте 50 микролитрами раствора смеси МС.Опять же, разбавьте 80 микролитрами смеси MS и перенесите аликвоту из 20 микролитров в пластину MTP для анализа режима отрицательной ионизации. Оберните тарелку фольгой и держите при температуре 4 градуса Цельсия перед анализом. Калибруйте МС как в положительном, так и в отрицательном режимах в соответствии с инструкциями производителя не более чем за 5 дней до анализа.Установите наноисточник прямой инфузии заранее, убедившись, что он правильно выровнен по переносному капилляру MS и чипу сопла 4,1 микрометра в держателе чипа, затем проверьте параметры положительной и отрицательной инфузии, соответствующие давлению газа 1,25 фунта на квадратный дюйм, напряжение источника 1,1 киловольта, 5 микролитров объема впрыска образца, выход контакта замыкания Rel1 на 2,5 секунды, 5 минут времени подачи, охлаждение пластины при 4 градусах Цельсия, затем настройка регулятора температуры и создание новой пластины. Для положительного режима проверьте и настройте программное обеспечение, которое настроено на метод MS с капиллярной температурой 250 градусов Цельсия и уровнем RF объектива S на уровне 65,0. В программном обеспечении Xcalibur откройте положительный метод и убедитесь, что полное сканирование MS установлено от нуля до 1 минуты в диапазоне от 550 до 1 000 м/з при разрешении 140 000 с автоматической регулировкой усиления 1 миллион и максимальным временем впрыска 50 миллисекунд.Применим замок массой 680.48022. Убедитесь, что независимый от данных метод сбора данных MS/MS настроен в диапазоне времени от 1 до 5 минут с разрешением 17 500 с фиксированной первой массой 250 м/z. Убедитесь, что автоматическая регулировка усиления для MS2 настроена на 100 000, а максимальное время впрыска - на 64 миллисекунды, энергия столкновения - 20 NCE, изолирующее окно - на 1 m/z и что используется список масс включения от 398 до 1 100 м/z с шагом массы 1 Дальтон.Для сбора данных в отрицательном режиме проверьте в программном обеспечении настройки, что метод MS настроен с капиллярной температурой 250 градусов Цельсия на уровне RF объектива S-lens на уровне 65.0 в файле настройки MS. Затем в программном обеспечении Xcalibur убедитесь, что режим сбора данных с полным сканированием настроен от нуля до 1 минуты с разрешением 140 000, охватывающим диапазон от 400 до 940 м/з, автоматическая регулировка усиления 1 миллион, максимальное время впрыска 200 миллисекунд и масса блокировки 526,46262. Убедитесь, что сбор данных MS2 в режиме DIA настроен между 1 и 5 минутами прогона с разрешением 17 500 с фиксированной первой массой 150 м/з, автоматической регулировкой усиления 100 000, 64 миллисекунды максимального времени впрыска и 35 NCE энергии столкновения с использованием списка масс включения от 400 до 940 с шагом массы 1 Дальтон.Создайте очередь последовательности анализа в программном обеспечении Xcalibur в положительном режиме и запустите ее, затем создайте последовательность в программном обеспечении ChipSoft и начните анализ, ожидая, пока сбор образца будет инициирован сигналом замыкания контакта, поступающим от робота прямой инфузии для каждого образца. Когда анализ положительного режима завершен, создайте очередь последовательности анализа в программном обеспечении Xcalibur в отрицательном режиме и запустите ее, затем создайте последовательность в программном обеспечении ChipSoft и начните анализ, ожидая, пока захват образца будет запущен сигналом замыкания контакта, поступающим от робота прямой инфузии для каждого образца. Общая нормализованная концентрация липидов была идентифицирована и количественно определена из 14 наиболее распространенных классов липидов, которая была немного повышена для классов липидов PE, PEO, PC, PCO, PI и PG, и некоторое снижение регуляции наблюдалось для липидов SM, LPE и PA.В то время как никакой разницы не было видно для тегов и PS. Эти результаты также показывают, что среди молекулярных особенностей, основанных на общей молекулярной формуле, от 100 до 120 соединений были значительно затронуты воздействием сигаретного дыма. Деконволюция фрагментации MS2 и нормализация интенсивности сигнала фрагмента позволили приблизительно определить общее количество каждой конъюгированной жирной кислоты, представленной в каждом липидном стакане, и сравнить эти данные между группами, подвергшимися воздействию, и контрольной группой. Наблюдалось снижение полностью насыщенных и ненасыщенных ненасыщенных жирных кислот, тогда как полиненасыщенные жирные кислоты в составе классов фосфолипидов PC, PE и PG были повышены в группе сигаретного дыма за все моменты времени.Крайние случаи ПК и ПГ, конъюгированные с эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислотой, были выявлены исключительно в группе воздействия 3R4F CS. Пипетирование образца и образца контроля качества должно выполняться с помощью низкочастотных наконечников и быть точным, то есть наконечники должны проверяться между каждым образцом. Пипетирование внутреннего стандартного решения имеет решающее значение и должно быть точным.С раствором 1-1 дихлорметан-метанола следует обращаться осторожно, и следует использовать наконечники, не содержащие пластификатор, чтобы избежать попадания пластиковых полимеров в образцы. Наконечники необходимо менять между каждыми образцами.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Биохимия

Цель данного документа – представить пошаговые процедуры для сбора различных белой жировой ткани от мышей, обработки жира образцов и извлечь РНК.

Мышь жировой ткани сбора и обработки для анализа РНК

В этой статье представлен модульный протокол для тканевой липидомики и транскриптомики, а также плазменной липидомики в моделях неврологических заболеваний мышей, нацеленных на липиды, лежащие в основе воспаления и активности нейронов, мембранные липиды, последующие мессенджеры и ферменты / рецепторы, кодирующие мРНК, лежащие в основе липидной функции. Описаны процедуры отбора проб, обработки проб, извлечения и количественной оценки.

Липидомика и транскриптомика при неврологических заболеваниях

Целью этого протокола является синтез флуоресцентно меченных липосом и использование проточной цитометрии для выявления in vivo локализации липосом на клеточном уровне.

Подготовка, введение и оценка тканеспецифического клеточного поглощения in vivo липосом, меченных флуоресцентным красителем

Описанный протокол обеспечивает оптимизированный количественный протеомический анализ образцов тканей с использованием двух подходов: на основе меток и свободного количественного определения меток. Подходы, основанные на этикетках, имеют преимущество в более точном количественном анализе белков, в то время как подход без маркировки является более экономически эффективным и используется для анализа сотен образцов когорты.

Комплексный рабочий процесс протеомики образцов тканей на основе масс-спектрометрии

В этой статье представлены три простых и доступных анализа для оценки липидного обмена у мышей.

Оценка способности всего тела к обработке липидов у мышей

Подробный протокол и три скрипта Python предоставляются для работы роботизированной системы обработки жидкостей с открытым исходным кодом для выполнения полуавтоматизированной подготовки образцов белка для экспериментов масс-спектрометрии, охватывающих удаление моющих средств, переваривание белка и этапы обессоливания пептидов.

Обработка образцов протеомики дробовика автоматизирована лабораторным роботом с открытым исходным кодом

Целью этого протокола является предоставление подробных рекомендаций по надлежащей подготовке образцов для анализа липидов и метаболитов в небольших тканях, таких как мозг дрозофилы , с использованием масс-спектрометрии с помощью матрицы лазерной десорбции / ионизации (MALDI).

Подготовка образцов для быстрого анализа липидов в мозге дрозофилы с использованием матричной лазерной десорбции / ионизационной масс-спектрометрии

Триглицеридный липолиз в адипоцитах является важным метаболическим процессом, приводящим к высвобождению свободных жирных кислот и глицерина. Здесь мы приводим подробный протокол измерения базального и стимулированного липолиза в адипоцитах и жировой ткани ex vivo у мышей.

Измерение скорости липолиза в мышиной жировой ткани ex vivo и первичных преадипоцитах, дифференцированных in vitro

В данной статье мы описываем протокол использования четырехмерной ультразвуковой визуализации in vivo и масс-спектрометрической визуализации ex vivo для оценки биомеханических и биомолекулярных изменений в сердечно-сосудистой системе мышей. Этот метод применяется для анализа ремоделирования сердца при хирургически индуцированном инфаркте миокарда и сосудистых изменениях у стареющих животных.

Мультимодальное исследование мышиного сердечно-сосудистого ремоделирования: четырехмерная ультразвуковая и масс-спектрометрическая визуализация

Модифицированный северный блоттинг метод измерения N 6 -methyladenosine (м 6 а) изменения в РНК описана. Текущий метод может обнаружить изменения в различных РНК и элементов управления в различных экспериментальных конструкций.

Метод для измерения РНК<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

Изучите метод масс-спектрометрии для количественной липидомики тканей грызунов. Этот протокол позволяет профилировать более 400 молекулярных липидов в 14 классах и выявлять ранние биомаркеры токсичности.

Липидомика тканей грызунов

Больше видео