Внутренняя чувствительность митохондриальной мембраны к Na+ раскрывает частично сегментированные функциональные пулы CoQ
20 июля 2022 г.
Этот протокол описывает сравнительный анализ с использованием митохондриальных комплексных активностей CI+CIII и CII+CIII при наличии или отсутствии Na+, для изучения существования частично сегментированных функциональных пулов CoQ.
Этот протокол подчеркивает роль натрия в качестве второго мессенджера, а также показывает существование частично дифференцированных пулов убихинола. Этот метод демонстрирует чрезвычайно простой подход к изучению пулов убихинолов, который в противном случае требует очень специфических моделей клеток. Этот подход может быть использован для изучения переноса электронов в других мембранах, особенно ферментов в липидных каплях.
Разделите образцы на четыре субобразца по 20 микрограммов каждый и пометьте их от A до D.Разделите образцы A и B на два субобразца по 10 микрограммов каждый и пометьте их как A1, A2, B1 и B2. Подготовьте буфер C1/C2, как описано в текстовом протоколе, и разогрейте до 37 градусов цельсия. В одном миллилитре кюветы добавьте каждый из субобразцов к 30 микролитрам цитохрома c и 10 микролитрам малоната. Добавьте буфер C1/C2, чтобы увеличить объем до 980 микролитров в кюветах A1 и B1 и 979 микролитров в A2 и B2. Добавьте 10 микролитров одномолярного хлорида калия в кюветах А1 и А2 и 10 микролитров одномолярного хлорида натрия в В1 и В2. Добавьте один микролитр одномимолярного ротенона в кюветы A2 и B2. Непосредственно перед измерением добавьте 10 микролитров 10-миллимолярного NADH во все кюветы.
Переверните кювету три раза и поместите ее в спектрофотометр. В прилагаемом программном обеспечении нажмите «Измерить, затем параметры», затем перейдите в «Общие» и установите параметры измерения на длине волны 550 нанометров и времени на четыре минуты чтения. Нажмите OK и Start, чтобы начать эксперимент.
В конце измерения сохраните наклон, включающий линейное увеличение поглощения, щелкнув Файл и Сохранить как.Разделите образцы C и D на два субобразца по 10 микрограммов каждый и пометьте их как C1, C2, D1 и D2. Смешайте каждый из субобразцов в одномиллилитровой кювете с 30 микролитрами цитохрома c и одним микролитром ротенона. Добавьте буфер C1/C2, предварительно нагретый при 37 градусах Цельсия, чтобы увеличить объем до 980 микролитров в кюветах C1 и D1 и 970 микролитров в C2 и D2. Добавьте 10 микролитров одномолярного хлорида калия в кюветы C1 и C2 и 10 микролитров одномолярного хлорида натрия в D1 и D2. Добавьте один микролитр одномимолярного антимицина А в кюветы C2 и D2 непосредственно перед измерением и 10 микролитров одномолярного сукцината во все кюветы. Переверните кювету три раза и поместите ее в спектрофотометр.
Выполните измерение и сохраните наклон, включающий линейное увеличение поглощения в конце измерения. Этот протокол использовался для изучения влияния ионов натрия на восстановление цитохрома c митохондриальными мембранами при добавлении NADH или сукцината. Следы поглощения, полученные на 550 нанометрах для образцов A и B, были скорректированы на их соответствующее ингибирование.
Эти следы показали аналогичный наклон, указывающий на аналогичную активность NADH-цитохрома c оксидоредуктазы. Однако следы для образцов C и D были разными, показывая, что сукцинат-цитохром c оксидоредуктазы активности образца C выше, чем у образца D.In чтобы нормализовать величину изменения, измеренного с помощью этого метода, другие методы могут быть дополнительно выполнены, такие как изолированная комплексная активность I, комплекс II или комплекс III. Используя эту технику, мы исследуем физиологические условия, в которых натрий может быть задействован в качестве второго мессенджера.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе освещается роль натрия как вторичного посредника и демонстрируется существование частично дифференцированных пулов убихинола. Он предлагает простой подход к изучению пулов убихинола, которые обычно требуют использования специфических клеточных моделей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
Теоретическая часть
- Натрий играет важнейшую роль в клеточной сигнализации.
- Пулы убихинола необходимы для процессов переноса электронов.
- Традиционные методы изучения этих пулов могут быть сложными.
- Данный протокол предлагает упрощенную альтернативу.
Цель исследования
- Изучить роль натрия в дифференциации пула убихинола.
- Разработать простой метод анализа активности митохондриальных комплексов.
- Углубить понимание механизмов переноса электронов.
Используемые методы
- Подготовка субфракций из митохондриальных экстрактов.
- Использование цитохрома c и малоната в кюветах для проведения анализов.
- Добавление хлорида калия и хлорида натрия для оценки их воздействия.
- Измерение активности переноса электронов с использованием NADH.
Основные результаты
- Продемонстрировано влияние натрия на дифференциацию пула убихинола.
- Показана применимость данного анализа для изучения переноса электронов.
- Подтверждено существование частично сегментированных функциональных пулов CoQ.
Выводы
- Данный протокол представляет собой ценный инструмент для изучения митохондриальной функции.
- Он упрощает исследование сложных биохимических процессов.
- В дальнейшем метод может быть применен и для изучения других мембраносвязанных ферментов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Сегментация пулов убихинона (CoQ) внутри внутренней мембраны митохондрий (ВММ) напрямую влияет на эффективность переноса электронов и снижение механических рисков на ранних этапах поиска лекарственных средств. Данный протокол позволяет проводить быструю количественную оценку функциональной дифференциации пулов CoQ и их чувствительности к натрию, что обеспечивает прогностическую уверенность при валидации митохондриальных мишеней. Этот подход оптимизирует оценку динамики ВММ, помогая принимать решения по формированию портфеля препаратов на стыке метаболизма и биоэнергетики.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать пути переноса электронов в митохондриях и сегментацию пула CoQ.
- Способствует механистическому снижению рисков путем разграничения натрий-чувствительной и натрий-нечувствительной оксидоредуктазной активности.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней для белков и комплексов, ассоциированных с внутренней мембраной митохондрий (IMM).
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированный количественный анализ активности переноса электронов в IMM с использованием NADH и сукцината в качестве доноров.
- Позволяет получать воспроизводимые данные о восстановлении цитохрома c в заданных ионных условиях.
- Обеспечивает масштабируемость анализа и возможность повторного использования платформы для скрининга соединений, воздействующих на митохондриальную функцию.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласуется с моделями соответствующих заболеваний, при которых задействована митохондриальная дисфункция.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации, позволяя проводить сравнительный анализ динамики ВММ.
- Позволяет снизить прогностические риски для соединений, модулирующих натриевую сигнализацию или перенос CoQ.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ занимает промежуточное положение в континууме от поиска мишеней до доклинических исследований, связывая ранние исследования механизмов с трансляционными исследованиями митохондриальных мишеней.
- Открывающая биология: Позволяет количественно определить натрий-зависимый и натрий-независимый перенос электронов, уточняя сегментацию путей ВММ.
- Скрининг: Стандартизирует измерение восстановления цитохрома c, стимулируемого NADH и сукцинатом, для обеспечения достоверности сравнения.
- Аналитика: Обеспечивает количественные данные на основе абсорбции для анализа различных условий и нормализации.
- Трансляционные исследования: Позволяет оценивать функциональные состояния ВММ в релевантных для заболеваний моделях митохондрий.
- Применение в промышленности: Может быть адаптировано для более широких исследований переноса электронов в других мембранных системах или липидных средах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность валидации митохондриальных мишеней и понимание механизмов их действия.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые функциональные анализы внутренней мембраны митохондрий (IMM).
- Стратегическая ценность: Помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), уточняя влияние натрия на перенос электронов в IMM и функцию пула CoQ.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию митохондриальных мишеней и соединений, модулирующих уровень натрия, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения митохондрий и спектрофотометрического анализа.
- Необходим доступ к стандартному лабораторному оборудованию для измерения оптической плотности.
- Требуется межкомандная стандартизация подготовки образцов и контролей ингибиторов.
- Метод адаптируем для различных источников митохондрий и, потенциально, для других мембранных систем.
- Ограничено оценкой in vitro; физиологическая экстраполяция требует дополнительной валидации.
