Прижизненная широкополевая флуоресцентная микроскопия микроциркуляции легких при экспериментальном остром повреждении легких с использованием вакуум-стабилизированной системы визуализации

Этот протокол подробно описывает хирургическую подготовку и использование вакуум-стабилизированной системы для изображения легочной лейкоцитарной адгезии и капиллярной перфузии in vivo. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет стабильно проводить прижизненную визуализацию неповрежденного зеркального легкого с высоким разрешением с минимальной физической травмой. Для начала подготовьте окно визуализации, введя тонкий слой вакуумной смазки в верхнюю часть наружного кольца, избегая загрязнения вакуумного канала.

Поместите чистую 8-миллиметровую стеклянную крышку на окно и осторожно прижмите вниз, чтобы создать уплотнение. Подключите окно визуализации к вакуумному насосу, оснащенному цифровым манометром и способному обеспечить всасывание от 50 до 60 миллиметров ртутного постоянства. Пропустите длину волоконно-оптического кабеля через эндотрахеальную канюлю 20-го калибра и погрузите наконечник в лидокаин HCL.

После анестезии вставьте модифицированный отоскоп, чтобы верхние резцы помещались в промежутке в зеркале. Отрегулируйте прицел и положение языка до тех пор, пока надгортанник и голосовые связки не станут хорошо видны. Вставьте волоконно-оптический кабель через зазор в зеркале и используйте небольшие круговые движения, чтобы пропустить кабель между голосовыми связками, затем, используя волоконно-оптический кабель в качестве направляющей, осторожно сдвиньте канюлю в трахею, чтобы интубировать мышь.

После начала вентиляции с 1,5% изофлурана, подтвердите глубину анестезии путем тестирования на педальный рефлекс. Прикрепите канюлю к морде медицинской лентой. Используйте маркировочную ленту, чтобы закрепить правую переднюю лапу на грелке в положении «девять часов», вытяните левую заднюю лапу каудально и закрепите ее в положении «шесть часов».

Используя тканевую ленту, слегка растяните левую переднюю опору до положения «12 часов» и закрепите другой конец ленты к верхней части платформы для прижизненной микроскопии, затем примените ректальный температурный зонд и пульсоксиметр лапы для мониторинга жизненно важных показателей на протяжении всего эксперимента. Чтобы подготовить мышь к операции, стерилизуйте грудную клетку и брюшную полость 70% спиртовой салфеткой и нанесите легкий слой минерального масла, чтобы смочить волосы на левой стороне мыши. Сделайте небольшой разрез вблизи нижней части грудной клетки, чтобы обнажить нижележащий мышечный слой, затем вытяните начальный разрез и используйте тупое рассечение, чтобы обнажить грудную клетку.

С помощью гемостатических щипцов захватите рассеченную эпителиальную и жировую ткань и поместите подальше от хирургической области. Чтобы флуоресцентно маркировать лейкоциты и кровоток, вводите 2,5 миллилитра на килограмм болюса родамина 6G и FITC-альбумина через хвостовую вену. Используя зубчатые щипцы, захватите ребро сразу же ниже положения основания легкого на конце вдоха.

Слегка втяните щипцы, чтобы оттянуть ребро от легкого, а затем перережьте ребро, чтобы вызвать пневмоторакс. Вытяните разрез в боковом направлении в обе стороны, следя за тем, чтобы не коснуться легкого. Захватите следующее самое высокое ребро тупыми щипцами и слегка втяните, чтобы позволить легкому отпасть от грудной стенки.

Если легкое не отделяется, слегка прижмите стенку грудной клетки к легкому, чтобы заставить легкое прилипнуть к нижележащей плевре и, таким образом, легче отпасть. Продолжайте первоначальный разрез в конечном итоге до грудины и краниально до тех пор, пока верхушка легкого не будет открыта. Используйте хлопковые аппликаторы и марлю, чтобы ослабить любое кровотечение, которое возникает.

Поднимите грудную клетку, чтобы обнажить межреберные кровеносные сосуды на дорсальном аспекте грудной полости, следя за тем, чтобы не повредить легкое, прижигайте самый нижний межреберный сосуд возле позвоночного столба, затем перережьте прилегающее ребро. Двигаясь черепно, и, в конце концов, используйте повторяющуюся схему прижигания и резки, чтобы иссечь примерно одну на два сантиметра часть грудной клетки. Чтобы подготовиться к визуализации, перенесите платформу прижизненной микроскопии на стадию микроскопа и расположите окно визуализации непосредственно над открытым легким.

Используйте микроманипулятор, чтобы осторожно опустить окно визуализации, пока оно не прилипнет и не стабилизирует поверхность легких. Для визуализации легочной микроциркуляции используйте широкоугольный флуоресцентный микроскоп, оснащенный 20-кратным объективом и стандартными наборами фильтров FITC и Rhodamine. Используйте черно-белую ПЗС-камеру для записи видео с оптимальной контрастностью.

Используя набор фильтров FITC, определите легочное место на основе конвергентного паттерна кровотока и запишите 30-секундное видео с местом в фокусе, а затем повторите запись в том же поле зрения, используя набор фильтров родамина для визуализации лейкоцитов. Чтобы найти легочную артерию, используйте набор фильтров FITC для идентификации сосуда с расходящимся паттерном кровотока и записи 30-секундного видео. Повторите запись в том же поле зрения, используя набор фильтра Родамин для визуализации лейкоцитов.

Чтобы найти интересующие капиллярные области, используйте набор фильтров FITC для идентификации области альвеол и капилляров, не пересекаемых более крупными сосудами, и запишите 30-секундное видео. Повторите запись в том же поле зрения, используя набор фильтра Родамин для визуализации лейкоцитов. Это видео изображает FITC визуализацию кровотока в легочном месте, как указано зеленой стрелкой.

Визуализация родамина позволяет визуализировать лейкоциты в одном и том же месте с двумя адгезивными лейкоцитами, обозначенными красными стрелками. Эти методы также применялись для визуализации тех же явлений и легочных артерий и капиллярных областей, представляющих интерес. Чтобы продемонстрировать количественную оценку микроциркуляторных параметров, мышей лечили интраназальным ЛПС, чтобы вызвать воспаление легких.

Незаконный оборот лейкоцитов в легочных местах показан здесь с очерченными областями, представляющими проанализированные эндотелиальные области у наивных и обработанных ЛПС мышей. Адгезия лейкоцитов и катание были увеличены у мышей, получавших ЛПС. Трафик лейкоцитов в легочных артериях показан здесь с очерченными областями, представляющими проанализированные эндотелиальные области у наивных и обработанных ЛПС мышей.

Адгезия лейкоцитов была выше у мышей, получавших ЛПС. Этот рисунок показывает адгезию лейкоцитов в легочных капиллярах у наивных и обработанных ЛПС мышей. Было показано, что адгезия лейкоцитов выше у мышей, получавших ЛПС, по сравнению с наивными.

На этом рисунке показана перфузия легочных капилляров у наивных и обработанных ЛПС мышей. Было показано, что функциональная плотность капилляров ниже у мышей, получавших ЛПС, по сравнению с наивными. Есть много сложных аспектов этого протокола.

Оптимизация позиционирования мыши на платформе является простым шагом, который может сделать хирургические и визуальные шаги гораздо более воспроизводимыми. Эта процедура адаптируется к широкому спектру параметров исследования и подходов микроскопии. Поэтому он должен способствовать дальнейшему исследованию легочной микроциркуляции как в здоровых, так и в больных состояниях.