Поддержание клеточного разнообразия глиобластомы человека Ex vivo с использованием трехмерной органоидной культуры

Здесь мы описываем метод генерации органоидов глиобластомы (GBM) из первичных образцов пациента или клеточных культур пациента и поддержания их до зрелости. Эти органоиды GBM содержат фенотипически разнообразные клеточные популяции и воссоздают микроокружение опухоли ex vivo.

Поиск методов лечения глиобластомы является сложной задачей из-за клеточного разнообразия, которое существует в опухолях, и взаимодействий между различными микросредами. Органоиды могут помочь воссоздать часть этого пространственного разнообразия, и мы можем использовать это, чтобы лучше понять биологию опухолей. В то время как традиционные методы культивирования клеток, как правило, производят однородные популяции опухолевых клеток, органоиды могут лучше имитировать молекулярное и клеточное разнообразие глиобластомы и лучше моделировать внутриопухолевые взаимодействия.

Органоиды могут быть использованы для исследования эффективности препарата и механизмов резистентности. Устойчивость к клинической терапии может проявляться только у органоидов, а не в традиционной отраслевой культуре, отражающей клиническую реальность этого заболевания. Органоиды могут помочь продемонстрировать региональные эффекты химиотерапии.

Они могут быть использованы для открытия новых нишевых специфических методов лечения, а также могут выступать в качестве прогностического инструмента для персонализированной медицины в будущем. Некоторые материалы, используемые для создания органоидов, чувствительны к температуре, и пренебрежение поддержанием этих материалов при их надлежащей температуре может привести к трудностям в создании или поддержании органоидов. Начните подготовку органоидных форм под культуральным капюшоном, сняв восковую бумагу с листа парапленки и поместив ее между двумя стерильными 96-луночными полимеразными цепными реакциями или пластинами ПЦР.

Убедитесь, что внутренняя часть парапленки чистая. Приложите равномерное давление к верхней пластине, чтобы сформировать небольшие ямочки глубиной два миллиметра в парапленке, не создавая отверстий. Отделите пластины.

Парапленка с ямочками будет прилипать к верхней пластине. Затем поместите верхнюю пластину на сухой лед на 30 секунд. Используйте стерильные щипцы, чтобы быстро вытащить парапленку с верхней пластины.

Замороженную парапленку легче удалить. Поместите готовую форму парапленки в закрытую стерильную 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток. Чтобы приготовить одноклеточную суспензию из глиобластомы или адгезивной культуры GBM, удалите использованную среду с пластины.

Затем добавляют два миллилитра раствора для отсоединения клеток при комнатной температуре в пластину и инкубируют пластину при 37 градусах в течение трех минут. После подтверждения отслоения клеток от пластины под микроскопом добавьте восемь миллилитров полной нейробазальной среды, или среды NBMc, чтобы нейтрализовать раствор отслоения клеток. Процедите суспензию через один 70-микронный клеточный сетчатый фильтр.

Раскрутите клетки в 120 раз G в течение пяти минут. Затем удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре NBMc. Подсчитайте клетки из одноклеточной суспензии с помощью клеточного непроницаемого пятна.

Чтобы сделать органоиды из одноклеточной суспензии, добавьте соответствующее количество богатого ламинином внеклеточного матрикса, или lrECM, в небольшую центрифужную трубку в ведре со льдом или холодном блоке. Приготовьте клеточную смесь, содержащую 20 000 клеток на органоид. Тщательно перемешайте смесь клеточной суспензии lrECM, чтобы избежать оседания клеток, что приведет к образованию неоднородных органоидов.

Затем аккуратно выложите 20 микролитров смеси на форму парапленки, чтобы сформировать жемчужную каплю. Убедитесь, что наконечник пипетки охлаждается каждые два-три органоида, чтобы предотвратить полимеризацию lrECM. После того, как желаемое количество органоидов будет пипетировано на парапленочную форму в 10-сантиметровой культуральной пластине, инкубируйте органоиды при 37 градусах Цельсия в течение одного-двух часов в инкубаторе клеточной культуры.

После того, как органоиды затвердеют, аккуратно смойте органоиды с парапленочной формы средой NBMc с помощью наконечника P1000 и соберите их в новую 10-сантиметровую культуральную пластину, содержащую 20 миллилитров NBMc. Поместите культуральную пластину в инкубатор без встряхивания в течение четырех дней. Через четыре дня замените носитель в пластине.

Для этого поместите лист темной бумаги под тарелку для культивирования клеток. Наклоните тарелку и подождите 20 секунд. Когда органоиды полностью осядут на дне тарелки, медленно удалите среду с помощью широко открывающейся стеклянной пипетки.

После добавления новых носителей поместите пластину в инкубатор на орбитальный шейкер со скоростью 80 оборотов в минуту и обменивайтесь средой каждые два-три дня после этого. Рост органоида наблюдали с помощью световой микроскопии. На центральном снимке ранний рост органоидов показал миграцию и одноклеточную инвазию через lrECM.

Зрелые органоиды через семь недель были относительно размера копейки. Иммуногистохимическое окрашивание органоидов GBM фосфогистоном H3 выявило высокопролиферативные клетки с коричневым или фиолетовым видом в органоидном периметре по сравнению с ядром. Данные о жизнеспособности клеток для органоидов в 0,1% DMSO продемонстрировали интраорганоидную и межорганоидную консистенцию.

Обратите внимание на органоидную биомассу и подкисление сред. Если органоиды проходят через среды слишком быстро, обязательно чаще обменивайтесь средами или расщепляйте органоиды между дополнительными пластинами. Зрелые органоиды могут быть использованы для экспериментов с терапией или встроены и разделены для использования с иммуногистохимией или иммунофлуоресценцией.

Диссоциированные органоиды могут быть использованы для анализа FACS. Эти органоиды были недавно использованы в трехмерном функциональном скрининге для обнаружения мишеней, необходимых в пространственно различных нишах раковых стволовых клеток. Мы также используем эти модели для определения приоритетов различных лекарств и методов лечения до тестирования in vivo.