Высокопроизводительный мультиплексированный скрининг на диабет 1 типа, целиакию и COVID-19
5 июля 2022 г.
В соответствии с настоятельной необходимостью скрининга диабета 1 типа, целиакии и коронавирусной болезни 2019 года мы разработали высокопроизводительный электрохемилюминесцентный анализ 6-Plex для одновременного обнаружения всех четырех островковых аутоантител, аутоантител тканевой трансглутаминазы и антител к рецепторсвязывающему домену коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2.
Новый 6-Plex ECL-анализ является первым мультиплексным анализом, проверенным и в настоящее время применяемым в клинических испытаниях для скрининга населения в целом. Он одновременно объединяет шесть анализов аутоантител, подходящих для скрининга диабета 1 типа, целиакии и COVID-19 в большой популяции. По сравнению с текущим стандартным анализом аутоантител, этот метод может более эффективно проверять несколько аутоантител для нескольких аутоиммунных заболеваний одновременно.
Использование этого метода сделает крупномасштабный скрининг более осуществимым и специфичным для заболевания, что приведет к раннему прогнозированию заболеваний для профилактики и более точной диагностике для терапии. Для начала добавьте четыре микролитра биотинилированного gad65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и проинсулиновый антигенный белок в пробирку, содержащую 156 микролитров 1% BSA, и смешайте с 240 микролитрами соответствующих стрептавидин-конъюгированных линкеров, 1, 2, 3, 8, 9 и 10. Затем инкубировать смесь в течение 30 минут при комнатной температуре.
Aliquot 160 микролитров стоп-раствора в каждую пробирку и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Теперь возьмите 400 микролитров раствора смеси из каждой трубки и соедините их вместе. Добавьте в смесь четыре микролитра меченого рутением GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и проинсулинового антигена.
Затем добавляют 1,6 миллилитра стоп-раствора и 3,2 миллилитра PBS. Тщательно перемешайте все компоненты. И теперь раствор антигена готов к использованию в анализе.
Для 96-луночной ПЦР-пластины аликвотьте семь микролитров сыворотки на лунку и накройте пластину герметизирующей пленкой. Затем разогрейте сыворотки при 56 градусах Цельсия в течение 30 минут на аппарате ПЦР и кратковременно центрифугируйте пластину в 100 раз G в течение одной минуты. Добавьте 63 микролитра приготовленного раствора антигена на лунку, смешайте с сыворотками и накройте пластину ПЦР герметизирующей фольгой, чтобы избежать света.
Встряхните пластину на шейкере со скоростью 450 об/мин в течение двух часов при комнатной температуре. А затем высиживать пластину при четырех градусах Цельсия в течение 18-24 часов. Возьмите плиту 6-Plex из холодильника с четырьмя градусами Цельсия, чтобы пластина достигла комнатной температуры.
Затем добавьте 150 микролитров 3%Blocker A к каждой лунке пластины 6-Plex. Накройте пластину фольгой, чтобы избежать света. Положите тарелку обратно в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия и высиживайте на ночь.
В конце инкубации, как только тарелка будет извлечена из холодильника, снимите весь буфер с тарелки. Похлопайте тарелку по бумажным полотенцам, чтобы они высохли, и мойте ее трижды 150 микролитрами стирального буфера на каждую лунку каждый раз. Высушите пластину на бумажном полотенце и аликвотьте 30 микролитров сывороточного антигена, инкубируемого из каждой лунки ночной инкубирующей ПЦР-пластины в две лунки 6-Plex пластины.
Накройте тарелку фольгой, затем положите пластину на шейкер и встряхните со скоростью 450 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа. Сбросьте раствор, присутствующий в пластине 6-Plex, и промыть пластину три раза 150 микролитрами промывочного буфера 0,4 М хлорида натрия на скважину. После завершения третьей стирки высушите пластину на бумажном полотенце и добавьте в каждую лунку по 150 микролитров считывающего буфера.
Уровни шести аутоантител для GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA и COVID-19A из анализа 6-Plex ECL были хорошо коррелированы с их соответствующими шестью одиночными анализами ECL и текущим стандартным радиосвязывающим анализом. Значения индекса для каждой выборки для всех шести антител были рассчитаны по соответствующим положительным и отрицательным контрольным показателям. Наблюдалось значение индекса, превышающее значение отсечения, что указывало на положительный результат.
Аутоантитела в сыворотке крови нарушили меченый рутением антиген к биотинилированному антигену, образовав комплекс со специфическим линкером для построения мультиплексирующей платформы. Эта тактика делает крупномасштабный скрининг более осуществимым и более эффективным среди населения в целом на диабет первого типа и сопутствующие заболевания, что приводит к раннему прогнозированию и профилактике заболеваний.
Обзор
В данном исследовании представлен новый 6-плексный электрохемилюминесцентный анализ, разработанный для одновременного обнаружения аутоантител, связанных с сахарным диабетом 1 типа, целиакией и COVID-19. Целью данного анализа является повышение эффективности крупномасштабного скрининга этих аутоиммунных заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Аутоиммунитет
- Клиническая диагностика
- Электрохемилюминесцентный анализ
Обзор
- Сахарный диабет 1 типа и целиакия являются аутоиммунными заболеваниями, требующими раннего выявления.
- COVID-19 создал новые трудности в скрининге аутоиммунных заболеваний.
- Современные методы скрининга часто неэффективны и требуют больших временных затрат.
- Мультиплексные анализы позволяют расширить возможности скрининга за счет одновременного тестирования нескольких антител.
Цель исследования
- Разработать высокопроизводительный анализ для одновременного обнаружения нескольких аутоантител.
- Валидировать данный анализ для использования в клинических исследованиях.
- Способствовать раннему прогнозированию и профилактике заболевания.
Используемые методы
- Приготовление растворов антигенов с использованием биотинилированных и меченых рутением белков.
- Инкубация образцов сыворотки с приготовленными растворами антигенов.
- Использование 96-луночного ПЦР-планшета для обработки образцов.
- Корреляция результатов со стандартными анализами для валидации мультиплексного подхода.
Основные результаты
- 6-Плексный анализ ECL продемонстрировал сильную корреляцию с традиционными одиночными анализами.
- Значения индекса указывали на положительные результаты наличия аутоантител в образцах сыворотки.
- Данный анализ позволяет проводить эффективный скрининг нескольких аутоиммунных заболеваний.
- Результаты подтверждают возможность проведения крупномасштабного популяционного скрининга.
Выводы
- 6-Плексный анализ ЭХЛ является перспективным инструментом для раннего выявления аутоиммунных заболеваний.
- Этот метод повышает эффективность процессов скрининга.
- Он обладает потенциалом для улучшения результатов лечения пациентов за счет раннего вмешательства.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Валидированный 6-плексный анализ ECL обеспечивает высокопроизводительное мультиплексное обнаружение аутоантител при сахарном диабете 1 типа, целиакии и COVID-19, отвечая потребности в эффективном популяционном скрининге специфических заболеваний. Данная платформа повышает прогностическую достоверность на самом раннем этапе перехода от обнаружения к диагностике, поддерживая принятие решений по портфелю исследований аутоиммунных и инфекционных заболеваний с учетом рисков. Её внедрение в качестве основного инструмента скрининга демонстрирует значимый эффект на уровне предприятия в рамках трансляционных и доклинических рабочих процессов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает одновременное исследование нескольких аутоиммунных и вирусных мишеней в формате одного анализа.
- Снижает биологические риски за счет дифференциации специфических для заболевания профилей аутоантител.
- Повышает прогностическую точность для стратегий раннего выявления и профилактики заболеваний.
- Облегчает приоритизацию портфеля препаратов, обеспечивая мультиплексные количественные показатели для валидации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные мультиплексные системы для последующего скрининга и анализа биомаркеров.
- Стандартизирует условия анализа для обеспечения воспроизводимости и количественной сопоставимости образцов.
- Обеспечивает масштабируемый высокопроизводительный скрининг с минимальными требованиями к объему сыворотки.
- Позволяет достоверно оценивать воздействие соединений или вмешательств на несколько биомаркеров, значимых для заболевания.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям поиска биомаркеров, значимых для заболевания, что обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до клинической валидации.
- Предоставляет количественные данные, которые позволяют принимать обоснованные с учетом рисков решения о продвижении препаратов по доклиническим этапам разработки.
- Повышает эффективность прогностического снижения рисков путем корреляции мультиплексных профилей аутоантител с началом и прогрессированием заболевания.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Анализ 6-Plex ECL объединяет этапы раннего поиска, идентификации ведущих соединений и трансляционных исследований, обеспечивая плавный переход от проверки гипотез к доклинической валидации.
- Поисковая биология: обеспечивает надежную проверку гипотез и уточнение путей за счет мультиплексного детектирования аутоантител.
- Скрининг: дает воспроизводимые количественные результаты, подходящие для условий высокопроизводительного скрининга.
- Аналитика: предоставляет индексные значения и пороговые точки принятия решений для сравнения различных условий и статистического анализа.
- Трансляционные исследования: связывают этап поиска и клиническую валидацию путем сопоставления детекции биомаркеров с конечными точками, значимыми для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую масштабируемую платформу для будущих инициатив по мультиплексному скринингу.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов на ранних этапах исследования аутоиммунных и инфекционных заболеваний.
- Операционная ценность: Оптимизирует рабочие процессы за счет стандартизации, воспроизводимости и возможности высокопроизводимого масштабирования.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает возможность принятия обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки, а также эффективно управляет портфелем проектов благодаря предоставлению мультиплексных прикладных данных.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию кандидатов с учетом рисков и их дальнейшее продвижение на основе надежных мультиплексных данных о биомаркерах.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разработке мультиплексных иммуноанализов и электрохемилюминесцентной детекции.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для считывания ECL и высокопроизводительной обработке планшетов.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов анализа и конвейеров обработки данных.
- Может потребоваться адаптация для использования с различными типами образцов или моделями заболеваний по мере развития портфеля задач.
- Практические ограничения включают необходимость строгой валидации по сравнению с установленными однокомпонентными и радиолигандными анализами.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
