Изогенный чип почечного клубочка, разработанный из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Изогенный чип клубочка позволит моделировать конкретные заболевания пациентов и тестировать нефротоксичность, а также передовые приложения прецизионной медицины. Клубочковый эпителий и эндотелий получены из одной популяции индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, или IPSC. IPSC обладают неограниченным самообновлением и могут дифференцироваться практически в любой тип клеток.

Этот метод может быть использован для оценки патологических клеточных фенотипов и заболеваний. Чип органа, специфичный для пациента, также может служить платформой для скрининга лекарств и механистических исследований. Эта модель может быть применена для разработки тела на чипе системы, персонализированной для конкретного пациента.

Эта система имеет потенциал для прогнозирования специфических реакций пациента до клинического тестирования. Начните с осторожного добавления 25 микролитров раствора матрицы базальной мембраны 2 в мочевой канал и 20 микролитров в капиллярный канал чипа. Возьмите две стерильные 15-миллилитровые конические крышки трубки и заполните их 500 микролитрами стерильной дистиллированной воды.

Поместите колпачок в чашку Петри, чтобы предотвратить высыхание, и поместите крышку на тарелку. Высиживайте его при температуре 37 градусов по Цельсию в течение ночи. Продолжая аспирировать среду из колб Т75, содержащих 15-дневную культуру эндотелиальных клеток сосудов при 90% слиянии.

Добавьте пять миллилитров буфера отслоения клеток и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение пяти-семи минут. Затем переложите ячейки в коническую трубку объемом 15 миллилитров и добавьте пять миллилитров DMEM/F-12. Центрифуга в 200 раз G в течение пяти минут.

Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в 300 микролитрах эндотелиальной поддерживающей среды. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, чтобы получить примерно 2 миллиона клеток. Используя барьерный наконечник P200, промывайте верхний и нижний каналы микрофлюидного чипа 200 микролитрами DMEM/F-12, одновременно аспирируя с периферии розетки.

Крепко держите стружку с помощью барьерного наконечника P200, прикрепленного к аспиратору, вдали от выходного отверстия нижнего канала. Плотно вводят 20 микролитров суспензии эндотелиальных клеток сосудов в капиллярный канал чипа и осторожно аспирируют среду с периферии выхода. Проверьте под микроскопом наличие пузырьков или неравномерной плотности посева.

Аккуратно инвертируйте чип, чтобы клетки могли прилипать к базальной стороне гибкой мембраны PDMS. Поместите чип в держатель картриджа и добавьте три миллилитра PBS в картридж, чтобы предотвратить высыхание мембраны. Инкубируйте чип при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов.

Проверьте нижний канал под микроскопом на наличие сливающегося слоя клеток, прикрепленных к гибкой мембране PDMS. Промывайте неприкрепленные клетки, добавляя 200 микролитров эндотелиальной поддерживающей среды на входе нижнего канала при аспирации с периферии выходного отверстия капиллярного канала. Поместите чип обратно в картридж держателя и высиживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день аккуратно промыть капиллярный канал 200 микролитрами эндотелиальной поддерживающей среды. Промывайте мочевой канал 200 микролитрами DMEM/F-12 и опустите 50 микролитров DMEM/F-12 на входной и выходной порты. Исходя из промежуточных клеток мезодермы, заменяют промежуточную мезодермную индукционную среду из каждой лунки 12-луночной пластины одним миллилитром трипсина ЭДТА и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.

Осторожно соскребайте клетки с помощью клеточного лифтера и диссоциируйте клетки с помощью пипетки. Добавьте в каждую лунку два миллилитра раствора для нейтрализации трипсина и переложите ячейки в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Доведите объем клеточной суспензии до 50 миллилитров с помощью DMEM/F-12 и центрифуги в 200 раз больше G в течение пяти минут.

Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в 500 микролитрах промежуточной мезодермной индукционной среды для получения примерно 3 миллионов клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Удерживайте чип и плотно введите 25 микролитров клеточной суспензии в мочевой канал чипа, осторожно аспирируя среду с периферии выходного отверстия.

Проверьте наличие пузырьков или неравномерной плотности посева клеток. Добавьте три миллилитра PBS в картридж держателя чипа и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение трех часов. После инкубации промыть оба канала 200 микролитрами соответствующей клеточной культуральной среды.

Прикрепите пустые барьерные наконечники P200 в оба выхода мочевого и капиллярного каналов. Пипетка 200 микролитров эндотелиальной поддерживающей среды и вводят половину ее во входное отверстие капиллярного канала. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия таким образом, чтобы и входное, и выходное отверстие канала были прикреплены к наконечникам пипетки, заполненным средой.

Повторите эту процедуру для входа в мочевой канал с 200 микролитрами промежуточной поддерживающей среды мезодермы. Инкубируйте чипсы с наконечниками, встроенными при 37 градусах Цельсия в течение ночи. Чтобы подключить чипы к биореактору чипа органа, сначала удалите наконечники P200 из каналов.

Добавьте капли соответствующих сред на вход и выход мочевого и капиллярного каналов, чтобы предотвратить высыхание. Добавьте три миллилитра теплой среды индукции подоцитов к резервуару на входе в мочевыводящем отверстии и три миллилитра теплой эндотелиальной поддерживающей среды к капиллярному входному резервуару. Добавьте 300 микролитров соответствующей среды в резервуары для выпускных отверстий непосредственно над выходным портом.

Поместите стручки на лоток и в биореактор органного чипа. Используйте поворотный циферблат для выбора и запуска основного цикла в течение двух минут. Визуально осмотрите нижнюю сторону капсулы на наличие мелких капель во всех четырех жидкостных портах.

Чтобы обеспечить контакт между жидкостью и жидкостью между нижней стороной капсулы и микрофлюидными портами чипа, осторожно вставьте держатель чипа в капсулу. Осторожно нажмите на выступ держателя чипа внутрь и вверх. Аспирируйте избыточную среду с поверхности чипа.

Установите скорость потока биореактора микрореактора органа на уровне 60 микролитров в час. Установите циклическую деформацию на 10% при 0,4 герц. Используйте поворотный циферблат на биореакторе чипа органа, чтобы выбрать цикл регулирования и работать в течение двух часов.

Визуально осмотрите выпускные резервуары на предмет повышения уровня среды. Используйте поворотный циферблат на биореакторе чипа органа для выбора цикла регулирования. После 17-го дня посева ежедневно аспирируйте среду из выходных резервуаров мочевого канала по диагонали от порта, но держите некоторую среду в резервуаре.

Пополняйте входной резервуар мочевого канала до трех миллилитров среды индукции подоцитов каждые два дня в течение пяти дней. Через пять дней аспирируйте среду из мочевого канала, но держите некоторую среду в резервуаре. Ежедневно пополняйте входной резервуар мочевого канала тремя миллилитрами поддерживающей среды подоцитов.

Аналогично аспирировать среду из выхода капиллярного канала и ежедневно пополнять впускные резервуары эндотелиальной поддерживающей средой. Используя этот протокол, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки были использованы для разработки функциональной модели in vitro клубочка путем распространения сосудистых эндотелиальных клеток и подоцитов. На 21-й день после индукции подоцитов и распространения эндотелия сосудов клетки в чипах экспрессировали маркеры идентификации линии, такие как подоцин и нефрин для подоцитов, VE Cadherin и PECAM-1 для сосудистых эндотелиальных клеток.

Как у подоцитов, так и в слоях эндотелиальных клеток сосудов экспрессировался коллаген IV, который является наиболее распространенным белком GBM в почечном клубочке. Клубочковые чипы избирательно фильтровали небольшие молекулы, такие как инулин, из капилляра в мочевой канал, предотвращая при этом крупные белки, такие как альбумин, от выхода из капиллярного канала, демонстрируя селективную функцию молекулярной фильтрации. Во время эндотелиальной индукции на четвертый-седьмой день увеличение количества клеток может привести к образованию вторичного слоя клеток, но чрезмерное посево может вызвать агрегацию, которая может препятствовать дифференцировке.

Неожиданный поперечный поток жидкости между мочевым и капиллярным каналами может наблюдаться в случае недостаточной связи компонентов чипа PDMS, закупорки пути потока жидкости или нарушения фильтрационного барьера. При посеве эндотелия и эпителия и поддержании стружки с 15-го дня и далее важно визуально проверять наличие пузырьков воздуха в каналах на каждом шагу. В изогенном чипе клубочков можно вводить клинически значимые препараты-кандидаты для проверки их терапевтического потенциала или уровней токсичности.

Этот метод теперь открывает возможности для понимания генетической основы заболевания почек человека и разработки персонализированных терапевтических средств.