Индукционные и разнообразные показатели оценки экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита
9 сентября 2022 г.
Настоящий протокол описывает индукцию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита в мышиной модели с использованием миелинового олигодендроцитарного гликопротеина и мониторинг процесса заболевания с использованием клинической системы оценки. Экспериментальные симптомы, связанные с аутоиммунным энцефаломиелитом, анализируются с использованием микрокомпьютерного томографического анализа бедренной кости мыши и теста в открытом поле для всесторонней оценки процесса заболевания.
В настоящее время нет полного излечения рассеянного склероза. Наш протокол позволяет эффективно построить экспериментальную модель аутоиммунного энцефаломиелита, чтобы помочь изучить методы лечения рассеянного склероза. Основным преимуществом нашего протокола является более комплексная оценка лечения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита с разных точек зрения.
Сначала готовят миелин олигодендроцитарную гликопротеиновую пептидную эмульсию путем растворения лиофилизированного пептида и стерильного предварительно охлажденного PBS без ионов кальция и магния при рН 7,4. Добавьте один стерилизованный пятимиллиметровый стальной шарик в чистую двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку. Затем добавьте в трубку 500 микролитров полного адъюванта Фрейда, содержащего пять миллиграммов на миллилитр лиофилизированной микробактерии туберкулеза и 500 микролитров миелиновой олигодендроцитарной гликопротеиновой пептидной эмульсии.
Теперь осциллируйте трубку на тканевом лизере в течение 10 минут. Затем охладить тюбики на льду в течение 10 минут. Повторяйте процесс четыре раза, пока не образуется белый вязкий раствор.
Далее разводят раствор стебля коклюшного токсина 50 раз в стерильном PBS рН 7,4 без ионов кальция и магния для достижения конечной концентрации 200 нанограмм на 100 микролитров. Чтобы высадить всю первоначально приготовленную миелиновую олигодендроцитарную гликопротеиновую пептидную эмульсию в нижней части трубки, центрифугируют трубку при четырех градусах Цельсия в течение двух-трех секунд, нажав кнопку импульса на оборудовании. Аспирируйте миелиновую олигодендроцитарную гликопротеиновую пептидную эмульсию с помощью одного миллилитра шприца, оснащенного иглой 22 калибра, и перенесите эмульсию в новый 1-миллилитровый шприц-бочку.
Прикрепите к стволу иглу 26 калибра и закрепите соединение уплотнительной пленкой. Вводят 100 микролитров миелиновой олигодендроцитарной гликопротеиновой пептидной эмульсии подкожно с каждой стороны спинного отдела позвоночника мыши. После инъекции наблюдают автоматическое образование луковичных масс под кожей и спинкой.
Затем внутрибрюшинно вводят 100 микролитров коклюшного токсина той же мыши. Подготовьте реакционную камеру открытого поля и настройте систему видеоанализа для записи передвижения мыши. Чтобы очистить реакционную камеру перед экспериментом, распылите 70% этанола на всю площадь и протрите чистым бумажным полотенцем.
Затем поместите мышь в угол реакционной камеры. Чтобы начать съемку, нажмите на кнопку начать захват в строке меню системы видеозаписи и запишите время. Сохраняя тишину в тестовой комнате, дайте мыши свободно двигаться в течение пяти минут.
Затем остановите запись и сохраните видео. Поместите мышь обратно в клетку. Затем очистите испытуемую область 70% этанолом и приступайте к следующей мыши.
Держите усыпленную мышь плоско на рассекающем лотке и зафиксируйте конечности. Подержите кожу задних конечностей в мыши щипцами и откройте кожу и мышцы ножницами. Затем отделите бедренную кость от большеберцовой кости и тазобедренной кости, осторожно используя ножницы.
Удалите ножницами мышцы, прилипшие к бедренной кости. Затем поместите бедренную кость в 70% этанол при комнатной температуре. В этом исследовании оценивалась способность пептида миелина олигодендроцитов, полученного из гликопротеина, индуцировать EAE.
Мыши, которым вводили пептид, испытывали прогрессирующую потерю веса. После шести-девяти дней инъекции у них развились симптомы EAE, которые достигли пика через 14-16 дней. Графики треков из теста в открытом поле показали, что EAE изменяет нормальное исследовательское поведение мышей.
По сравнению с обычными мышами, мыши с EAE прошли значительно меньшее расстояние в фазах раннего начала, пика и ремиссии. Мыши с EAE также имели значительно сниженную продолжительность активности в фазах пика и ремиссии заболевания. Более того, во всех трех фазах мыши EAE имели значительно меньшее расстояние перемещения и времени, проведенного в центре.
Микрокомпьютерная томография бедренных костей у мышей EAE выявила трабекулярную архитектуру, отличную от нормальных мышей. Бедренные кости у мышей EAE имели значительно меньшую минеральную плотность кости и отношение объема кости к объему ткани, чем у нормальных мышей. Кроме того, бедренные кости у мышей с EAE имели меньшую плотность трабекулярного соединения, трабекулярное число и толщину трабекуляра, чем у нормальных мышей.
По сравнению с нормальными мышами, трабекулярное расстояние было увеличено, а толщина кортикальной кости была уменьшена у мышей EAE. Мы также можем выделить мозговой и спинной код мышей EAE на пике заболевания и проанализировать выработку иммунных клеток и цитокинов с помощью цитометрии гриппа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол индуцирования экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у мышей с использованием миелинового олигодендроцитарного гликопротеина (MOG). Предлагается комплексная оценка процесса заболевания с помощью клинического скоринга, микрокомпьютерной томографии и поведенческих тестов.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Нейроиммунология
- Исследование рассеянного склероза
- Моделирование аутоиммунных заболеваний
Теоретические основы
- Существование различных экспериментальных моделей для изучения рассеянного склероза.
- Важность надежной модели для оценки эффективности методов лечения.
- MOG является ключевым компонентом в патологии рассеянного склероза.
Используемые методы
- Индукция ЭАЭ с использованием эмульсии пептида MOG и коклюшного токсина.
- Мышиная модель
- Микрокомпьютерная томография и тесты в открытом поле для оценки.
Основные результаты
- У мышей наблюдалась прогрессирующая потеря веса и развитие симптомов ЭАЭ в течение двух недель после инъекции MOG.
- Поведенческий анализ выявил нарушение исследовательского поведения и снижение локомоторной активности у мышей с ЭАЭ.
- Микрокомпьютерная томография показала снижение плотности костной ткани и изменение структуры трабекул у мышей с ЭАЭ.
Выводы
- В ходе исследования была успешно создана комплексная модель ЭАЭ для дальнейшего изучения методов терапии рассеянного склероза.
- Полученные результаты имеют важное значение для понимания механизмов заболевания и разработки потенциальных терапевтических методов вмешательства.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) служат трансляционно значимой платформой для оценки терапевтических гипотез и минимизации механистических рисков при разработке препаратов для лечения рассеянного склероза (РС). Интеграция показателей поведенческой, скелетной и иммунологической оценки повышает прогностическую достоверность и обосновывает принятие решений по портфелю с учетом рисков на ранних стадиях поиска и в точках принятия решений на доклиническом этапе. Комплексное фенотипирование при ЭАЭ обеспечивает более надежную валидацию мишеней и позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки кандидатов в препараты для лечения РС.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы на релевантной модели аутоиммунного нейровоспаления при заболевании.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем установления связи между молекулярными вмешательствами и клиническими, поведенческими и скелетными фенотипами.
- Способствует снижению механистических рисков за счет многомерного анализа показателей, выходящих за рамки традиционного клинического скоринга.
- Повышает прогностическую достоверность при отборе проектов для портфеля за счет фиксации различных конечных точек, релевантных для рассеянного склероза.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные системы in vivo для последующего скрининга эффективности и изучения механизмов действия перспективных лекарственных препаратов для лечения рассеянного склероза.
- Стандартизирует оценку с помощью воспроизводимого клинического скоринга, поведенческого анализа и данных микро-КТ.
- Обеспечивает количественную оценку влияния соединений на нейровоспаление, поведение и состояние костной ткани.
- Поддерживает создание масштабируемых и многократно используемых платформ для сравнительного профилирования соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические конечные точки в соответствие с клиническими проявлениями рассеянного склероза у пациентов, включая тревожное поведение и остеопороз.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации путем интеграции иммунологических и фенотипических биомаркеров.
- Снижает риски при принятии решений о дальнейшем продвижении за счет предоставления многопараметрических доказательств эффективности и безопасности.
- Повышает трансляционную значимость при отборе кандидатов и разработке стратегии биомаркеров.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данная модель ЭАЭ связывает этапы раннего поиска, идентификации ведущих соединений и доклинической валидации терапевтических средств при рассеянном склерозе, обеспечивая возможность проверки гипотез, уточнения сигнальных путей и количественной оценки эффектов вмешательства.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку нулевой гипотезы и исследование механизмов нейроиммунных путей при РС.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные, воспроизводимые и количественные данные для оценки соединений.
- Аналитика: обеспечивает мультимодальные измерения — клинические баллы, поведенческие показатели и микроархитектонику костной ткани — для надежного сравнения состояний.
- Трансляционные исследования: сопоставляют доклинические результаты с фенотипами, значимыми для пациентов, и биомаркерными конечными точками.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу in vivo для итеративного поиска лекарственных средств и биомаркеров РС.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней при РС.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость исследований эффективности in vivo.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет интеграции различных показателей оценки.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритезацию и продвижение терапевтических кандидатов для лечения РС с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области нейроиммунологии, поведенческого анализа и визуализации костной ткани.
- Необходим доступ к оборудованию для микро-КТ, видеотрекинга и проточной цитометрии.
- Требуется межгрупповая стандартизация клинической оценки и протоколов поведенческого анализа.
- Может потребоваться адаптация метода для различных линий мышей или типов вмешательств, релевантных рассеянному склерозу.
- Сложность оценки возрастает при использовании многопараметрических конечных точек и интеграции данных.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Preparation of Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein Peptide (MOG35-55) Emulsion and Pertussis Toxin
1:55
Establishment of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Animal Model
2:55
Open Field Test
3:42
Analysis of Bone Phenotype
4:16
Results: Induction of EAE by MOG35-55 Treatment
5:49
Conclusion
