Культивирование и генетическое манипулирование энтомопатогенными нематодами

Эффективный протокол для поддержания и усиления энтомопатогенной нематоды имеет важное значение для понимания молекулярной основы патогенности нематод и иммунитета хозяина против нематод. Этот протокол позволяет нам производить большое количество симбиотических и аксениновых бактериофор Heterorhabditis и Steinernema carpocapsae IJ с использованием насекомого-хозяина, Galleria mellonella. Начните с того, что накройте чашку Петри кусочком фильтровальной бумаги и добавьте примерно от 10 до 15 личинок Galleria mellonella.

Используя пипетку, распределите два миллилитра воды, содержащих от 25 до 50 инфекционных молодых особей на 10 микролитров суспензии, на восковых червей. И храните чашку Петри в шкафу при комнатной температуре. В зависимости от влажности фильтровальной бумаги добавляйте от одного до двух миллилитров воды каждые два дня.

Восковые черви, зараженные инфекционными молодыми особями, обычно умирают в течение 48 часов. Подготовьте водные ловушки Уайта примерно через 10 дней после того, как восковые черви будут заражены инфекционными молодыми особями. Аккуратно перенесите мертвых насекомых на непромокшую часть фильтровальной бумаги.

Используйте водопроводную воду, чтобы заполнить нижнюю чашку Петри и поместите крышку 15-миллилитровой трубки в качестве распорки для вентиляции. Используйте водопроводную воду вместо деминерализованной или деионизированной воды, чтобы избежать агрегации нематод, и убедитесь, что уровень воды в ловушке для воды достигает примерно половины высоты чашки Петри. Когда вода в маленькой чашке Петри становится мутной из-за нематод, используйте пипетку, чтобы переместить новое поколение инфекционных молодых особей в колбу для культуры клеток T25 или T75.

Позже добавьте водопроводную воду до 40% объема или до тех пор, пока не будет достигнута соответствующая плотность. И храните колбу клеточной культуры горизонтально, чтобы избежать застойных явлений нематод. Повторите перенос инфекционных молодых особей в колбы для культивирования клеток и добавление воды до тех пор, пока инфекционная молодь не перестанет выходить из туш насекомых примерно через три-пять дней.

Используя петлю прививки, соскоблите несколько хлопьев замороженной культуры Photorhabdus temperata Ret16 на пластину Макконки и полосу для отдельных колоний. Инкубировать пластину в течение двух-трех дней при 28 градусах Цельсия. После инкубации привить 10 миллилитров бульона LB с колонией на агаре МакКонки в 50-миллилитровой трубке и высиживать культуру на ночь при 28 градусах Цельсия в трясущемся инкубаторе.

После инкубации переложите 100 микролитров ночной культуры из 50-миллилитровой трубки в новую микроцентрифужную трубку, затем промыть 100 ночных культур с 900 микролитрами однопрочной PBS путем центрифузии в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке, в 17 900 раз г. Декант супернатанта. Далее разбавляют культуру в 10 раз в разовой крепости PBS и оставляют трубку на льду.

Теперь погрузите восковых червей в 70% раствор этанола. После сушки насекомых бумажным полотенцем поместите их в 50-миллилитровую трубку. Поместите трубку на лед на 20 минут, чтобы обездвижить восковых червей.

Используйте фильтровальную бумагу, чтобы покрыть верхнюю и нижнюю половины чашки Петри. Используйте крышку чашки Петри, покрытую фильтровальной бумагой, в качестве базовой опоры для инъекций. Смочите в фильтровальной бумаге нижнюю чашку Петри и переложите ее на лед, чтобы помочь введенным восковым червям восстановиться.

Пипетка 50 микролитров ледяных бактерий на куске парапленки, затем подготовьте шприц из иглы 22-го калибра и осторожно прижмите поршень, чтобы удалить воздух на кончике иглы. Держа воскового червя близко к заднему концу под стереоскопом. Вводят бактериальную культуру в дорсальную сторону грудной клетки.

Предпочтительно на стыке между двумя сегментами прямо под кутикулой параллельно восковому червю свести к минимуму внутренние повреждения и обратить внимание на то, как тело личинки начинает выпячиваться. Далее перекладываем введенных насекомых на восстановительную чашку Петри. И как только все насекомые будут введены и помещены в восстановительную чашку, поместите чашку Петри в темноту.

Восковые черви погибают через два дня после инъекции и кажутся кирпично-красными примерно через три-четыре дня. Однако насекомые коричневого цвета указывают на неудачную бактериальную инфекцию. Через семь дней после заражения перенесите насекомых с характерным кирпично-красным цветом на свежую фильтровальную бумагу, выстланную чашкой Петри, и повторите производство симбиотической нематоды, заразной молоди.

Чтобы начать поверхностную стерилизацию, путем центрифугирования соберите достаточное количество симбиотиков, бактериофор гетерохабдитов и потенциальных аксеневых инфекционных молодей. Чтобы сделать гранулу в 1,5-миллилитровой центрифужной трубке, добавьте 500 микролитров 5% отбеливателя к грануле в каждой микроцентрифужной трубке и переверните трубку. После инкубации в течение 10 минут центрифугируют по 17 900 г в течение одной минуты и удаляют надосадочное вещество.

Затем промыть гранулу одним миллилитом стерильной воды. Центрифугируйте его, удалите супернатант и повторите эту процедуру еще четыре раза. На графике показаны результаты оценки состояния гетерорхабдита бактериофорных нематод, прошедших аксенизацию.

Бактериофора гетерорабдита из стоковой культуры переносила симбиотические клетки Photorhabdus luminescens. Однако нематоды, лишенные связанных с ними бактерий Photorhabdus luminescens, были аксениками. Чтобы сохранить воспроизводимость вашего эксперимента, всегда извлекайте свежую бактериальную культуру из свежей колонии и извлекайте культуру на ночь, прежде чем она достигнет неподвижной поверхности.

Используйте только кирпично-красного воскового червя Galleria для водяной ловушки Уайта и выбросьте остальные. После этой процедуры нематоды могут быть использованы для исследования взаимодействия с иммунной системой насекомых. Этот метод прокладывает путь для исследователя, чтобы исследовать молекулярную основу паразитизма нематод и иммунитета против нематод хозяина.