Name: Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Изучите электропорацию плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши для исследования физиологии мышц. Этот метод обеспечивает эффективную доставку генов без нарушения сократимости мышц.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Никакой

Все эксперименты с использованием животных проводились в Медицинском колледже штата Пенсильвания, одобрены Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Университета штата Пенсильвания и проводились в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и последующих поправках к ней. Для этой процедуры использовались 12-недельные самки мышей C57BL/6. Все хирургические инструменты были автоклавированы для стерильности перед экспериментами.
1. Препарат для инъекций/электропорации ТА и ЭДЛ
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы идентичны для приготовления инъекций/электропорации ТА и ЭДЛ.
<ol><li>Плазмиды очищения экспрессии до концентрации 1 мкг/мкл, разбавленной в стерильном PBS до начала эксперимента. Для этой процедуры использовался коммерчески доступный набор для очистки без эндотоксинов для очистки пустого вектора pcDNA3-EGFP (GFP) или pcDNA3 (контроль).</li>
	<li>Рассчитать концентрацию плазмиды для обеспечения адекватного объема инъекции (ТА 50 мкг ДНК в 50 мкл стерильного PBS; EDL 10 мкг ДНК в 10 мкл стерильных PBS) и аликвотные образцы.</li>
	<li>Запрограммируйте настройки электропоратора с помощью выбранного колеса и нажатием на колесо для выбора параметров следующим образом: Режим - НН, Напряжение - 12,5 В/мм (регулируется в момент впрыска), длина импульса - 20 мс, количество импульсов - 5, интервал - 200 мс, полярность - униполярная.</li>
	<li>Обезболивайте мышей, используя газ изофлуран. Поместите мышей в индукционную коробку с 5% изофлураном. Подтверждают хирургическую плоскость анестезии отсутствием рефлекса защемления пальца ноги с помощью щипцов и снижают изофлуран до 2% поддерживающей дозы. Переведите мышей в соответствующий носовой конус, опирающийся на пластину циркулирующей воды при 37 °C для остальной части процедуры.</li>
	<li>Удалите волосы с обеих задних конечностей с помощью небольших машинок для резания волос. Очистите нижние конечности чередованием 70% этанола / бетадина для дезинфекции области инъекции.</li>
</ol>2. Впрыск ТА/электропорация
<ol><li>Когда мышь находится в положении лежа, найдите сухожилие TA, видимое через кожу на боковой стороне голени. Используя микрошприц объемом 50 мкл со съемной иглой 30 Г, вставьте иглу на 1-2 мм выше миотендинозного соединения под небольшим углом 5°, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы. ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция в середину мышцы является целью.</li>
	<li>Медленно нажмите на плунжер, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы доставить 50 мкл плазмидного раствора. Мышца должна набухать.</li>
	<li>Установите таймер на 1 мин и измерьте толщину ножки на ТА. В зависимости от размера мыши это может быть от 5-10 мм. Установите электроды суппорта на измеряемую толщину и установите напряжение электропоратора на 12,5 В/мм.</li>
	<li>Через 1 мин поместите электроды суппорта вокруг нижней конечности. Электроды должны быть плотными, но не чрезмерно плотными. Подайте 5 импульсов квадратной волны с длительностью 20 мс и интервалами 200 мс (мышца должна дергаться с каждым импульсом).</li>
	<li>Повторите с альтернативной конечностью, используя контрольный вектор.</li>
	<li>Выньте мышь из наркоза и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 °C. После выздоровления верните мышь в клетку.</li>
</ol>3. Впрыск/электропорация EDL
<ol><li>Когда мышь находится в положении лежа, найдите передний гребень большеберцовой кости визуально и с помощью мягкой пальпации.<ol>
<li>С помощью скальпеля делают неглубокий разрез через кожу на боковой стороне переднего гребня большеберцовой кости на 5 мм ниже колена на 2 мм выше миотендинозного соединения ТА.</li>
		<li>С помощью небольших ножниц тупое рассечение фасции, обнажая мышцу ТА.</li>
		<li>Опять же, используя тупое рассечение ножницами, отделите мышцу ТА от большеберцовой кости осторожно, потянув мышцу сбоку, обнажив EDL. Небольшие, изогнутые щипцы могут быть использованы для поддержания ТА чистым от EDL во время процедуры.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Используя микрошприц объемом 50 мкл со съемной иглой 30 г, вставьте иглу в EDL продольно, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы.</li>
	<li>Медленно нажмите на плунжер, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы ввести 10 мкл плазмидного раствора (мышца должна набухать).</li>
	<li>Установите таймер на 1 мин и измерьте толщину ножки на EDL. В зависимости от размера мыши это может быть от 5-10 мм. Установите электроды суппорта на измеряемую толщину и установите напряжение электропоратора на 12,5 В/мм.</li>
	<li>Через 1 мин поместите электроды суппорта вокруг нижней конечности. Электроды должны быть плотными, но не чрезмерно плотными. Подайте 5 импульсов квадратной волны с длительностью 20 мс и интервалами 200 мс (мышцы должны дергаться с каждым импульсом).</li>
	<li>Закройте разрез одноразовыми нерассасывающимися нейлоновыми швами 4/0.</li>
	<li>Повторите с альтернативной конечностью или оставьте конечность нетронутой в качестве абсолютного контроля.</li>
	<li>Выньте мышь из наркоза и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 °C. Вводят соответствующий подкожный анальгетик сразу после операции и через 12-24 ч после операции. После выздоровления верните мышь в клетку. ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие исследования показали дефицит сократимости мышц в ТА сразу после электропорации и то, что сократительное восстановление происходит в течение 3 дней13,15. По этой причине анализ мышц ТА и ЭДЛ на гистологию, экспрессию белка или сократимость мышц проводится через 3-10 дней после электропорации. Длительная экспрессия EGFP наблюдалась до 3 недель после процедуры13.</li>
</ol>

<ol><li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li>
<li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp27+inhibits+IKK%CE%B2-induced+NF-%CE%BAB+activity+and+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li>
<li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Regulatory%2C+Integregrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li>
<li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li>
<li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li>
<li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle%3A+studies+on+isolated+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li>
<li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li>
<li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li>
<li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li>
<li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li>
<li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732(2015).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li>
<li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li>
<li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li>
<li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficacy%2C+longevity%2C+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li>
</ol>

B.A.H. и D.L.W не заявляют о конфликте интересов.

Перенос генов in vivo в скелетных мышцах, усиленный электропорацией, является полезным и относительно простым инструментом для модуляции экспрессии белка в мышцах. Мы показали шаги, необходимые для достижения эффективного переноса генов в мышцах EDL и TA, и продемонстрировали, что измерение сократимости EDL является жизнеспособным после процедуры. Этот метод не требует более сложных вирусных векторов и позволяет сравнивать трансфектированную и нетрансфектную область поперечного сечения мышечного волокна в одной ...

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы in vivo является важным инструментом для оценки изменений в физиологии скелетных мышц и молекулярной сигнализации путем модуляции экспрессии генов в различных физиологических и патофизиологических условиях 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Экспериментальный перенос генов в скелетные мышцы был продемонстрирован еще в 1990 году Wolff et al., где как РНК, так и ДНК были успешно перенесены без электропорации, а экспрессия люциферазы поддерживалась в течение не менее 2 месяцев10. Относительно низкая эффективность трансфекции только при инъекции проблематична, и Айхара и Миядзаки продемонстрировали повышенный перенос генов с электропорацией в 1998 году путем электропорации конструкции pCAGGS-IL-5 в переднюю мышцу большеберцовой кости (TA) и измерения экспрессии IL-5 сыворотки11. С тех пор во многих исследованиях изучалась эффективность различных концентраций ДНК, объемов и параметров электропорации для обеспечения максимальной эффективности переноса генов. Mir et al. проверили различные параметры электропорации, включая напряжение, число импульсов, продолжительность и частоту импульса, а также концентрацию ДНК, и определили, что большее напряжение, число импульсов и концентрация ДНК способствовали увеличению эффективности электропорации12. Основным предостережением к высокому электропорационному напряжению является то, что, хотя оно способствует увеличению поглощения ДНК миофибрами, оно также вызывает повреждение мышц, что может сбить с толку результаты. Schertzer et al. показали, что электропорация при 200 В вызывала повреждение примерно у 50% миофибров через 3 дня после электропорации, тогда как только 10% миофибров были повреждены при 50 В13. Мы приняли во внимание переменные, влияющие на эффективный перенос ДНК по сравнению с повреждением мышц, и обнаружили, что напряжение 125 В на сантиметр ширины суппорта достаточно для достижения эффективного переноса генов.
Анализ площади поперечного сечения мышечного волокна и сократимости всей мышцы после электропорации является важным аспектом метода измерения изменений размера и функции мышц из-за модуляции генов. Мы и другие ранее продемонстрировали, что электропорация контрольных векторов сама по себе не вызывает уменьшения площади миофибры. Конструкция зеленого флуоресцентного белка (EGFP) была полезным флуоресцентным индикатором трансфекции ДНК в этих исследованиях13,14. Ряд исследований исследовали сократимость ТА in situ после электропорации и обнаружили различные результаты. Одно исследование показало, что электропорация 75 В/см вызвала около 30% снижения тетановой силы через 3 дня после электропорации, а через 7 дней после электропорации тетаническая сила вернулась к контрольному уровню, в то время как электропорация 50 В/см не ставила под угрозу силу13,15. Другое исследование показало, что была 30% потеря тетанической силы через 3 ч после электропорации 180 В / см, которая восстановилась до фиктивных уровней силы через 7 дней16.
В следующей подробной процедуре мы демонстрируем инъекцию и электропорацию плазмиды PCDNA3-EGFP в мышцах ТА и разгибателя digitorum longus (EDL) мышей. Мы также демонстрируем, что этот метод не влияет на сократимость всей мышцы EDL. Цель состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективное поглощение плазмид в миофибрах, не вызывая потери функции.

<table><tbody><tr><td>4-0 Нейлоновый шовный материал (нерассасывающийся)</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>Шовный материал для закрытого разреза кожи</td></tr><tr><td>50&микро; l Шприц Hamilton</td><td></td><td>80501</td><td>микрошприц</td></tr><tr><td>C57BLl/6NHsd мыши</td><td>Envigo</td><td>044</td><td>12-недельные самки мышей, используемые для экспериментов</td></tr><tr><td>Электрод штангенциркуля</td><td>BTX</td><td>45-0102</td><td>1,0 см x 1,0 см нержавеющая сталь</td></tr><tr><td>Динамический контроль мышц Сбор / анализ данных</td><td>Aurora Scientific</td><td>605A</td><td>Программное обеспечение используется для измерения и анализа сократимости мышц</td></tr><tr><td>ECM 830 Электропорационная система</td><td>BTX</td><td>45-0662</td><td>Электропоратор</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Набор для очистки плазмид</td></tr><tr><td>Экстра узкие ножницы</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>Ножницы для тупого рассечения</td></tr><tr><td>Преобразователь силы</td><td>Aurora Scientific</td><td>407A</td><td>Для измерения силы от EDL</td></tr><tr><td>Micro-Masquito Hemastats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13010-12</td><td>Гемастаты для исследования</td></tr><tr><td>pcDNA3.1 вектор экспрессии у млекопитающих</td><td>Fisher Scientific</td><td>V79020</td><td>Контрольный вектор</td></tr><tr><td>экспрессии pcDNA3-EGFP плазмида</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td>Плазмида для экспрессии GFP</td></tr><tr><td>Изогнутые щипцы Semken</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td>Щипцы для хирургии</td></tr><tr><td>Хирургические лезвия из нержавеющей стали No 10</td><td>Becton Dickinson</td><td>37 1210</td><td>Лезвия скальпеля</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. media</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Замораживающие среды для гистологии</td></tr><tr><td>Агглютинин зародышей пшеницы- Texas Red</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>W21405</td><td>Мембранное окрашивание для сечения мышц</td></tr></tbody></table>

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Транзиторная модуляция экспрессии генов в мышиных скелетных мышцах путем плазмидной электропорации является полезным инструментом для оценки нормальной и патологической физиологии. Сверхэкспрессия или нокдаун генов-мишеней позволяет исследователям манипулировать отдельными молекулярными событиями и, таким образом, лучше понимать механизмы, которые влияют на мышечную массу, мышечный метаболизм и сократимость. Кроме того, электропорация плазмид ДНК, которые кодируют флуоресцентные метки, позволяет исследователям измерять изменения субклеточной локализации белков в скелетных мышцах in vivo. Ключевая функциональная оценка скелетных мышц включает измерение сократимости мышц. В этом протоколе мы демонстрируем, что исследования сократимости целых мышц все еще возможны после инъекции плазмидной ДНК, электропорации и модуляции экспрессии генов. Целью этой учебной процедуры является демонстрация пошагового метода плазмидной электропорации ДНК в скелетные мышцы мыши для облегчения поглощения и экспрессии в миофибрах передней и разгибательной мышц большеберцовой кости, а также демонстрация того, что сократимость скелетных мышц не нарушается инъекцией и электропорацией.

Электропорация для облегчения переноса генов в скелетных мышцах является полезным методом, используемым для оценки изменений в физиологии мышц. Мы продемонстрировали подробную, пошаговую процедуру для достижения эффективного переноса генов как в мышцах ТА, так и в мышцах EDL. Различия в эффективности трансфекции возникают из-за ряда переменных. Среди этих переменных - параметры электропорации (импульсы, напряжение, длительность импульса и т. Д.), Размер конструкции гена и концентрация / объем вводимой ДНК. Ранее мы показ...

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы является жизнеспособным методом модуляции экспрессии генов без ущерба для сократимости мышц у мышей.

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Электропорация-опосредованный перенос генов в мышцах является простым и эффективным методом исследования изменений в физиологии мышц. Мы обнаружили, что электропорация не ставит под угрозу сократимость мышц. Электропорация генных конструкций в мышцы in vivo – простая и эффективная процедура, не требующая более обширной упаковки генных конструкций в вирусные векторы.Трудно визуализировать, изолировать и вводить ЭДЛ из-за его расположения и небольшого размера. Практика на туше мыши и инъекция биологических чернил, таких как индийские чернила, могут помочь в предоставлении доказательств достаточной инъекции. Продемонстрировать процедуру будет Брайан Хейн, постдок из моей лаборатории.Перед инъекцией мыши подтвердите хирургическую плоскость анестезии с помощью щипцов с отсутствием рефлекса защемления пальца ноги, затем переместите мышь в носовой конус, покоящийся на циркулирующей водяной пластине при 37 градусах Цельсия для остальной части процедуры. После того, как мышь помещена в положение лежа на спине, удалите волосы с обеих задних конечностей с помощью небольших машинок для резания волос, затем продезинфицируйте область инъекции с чередованием 70% этанола и бетадина. Для инъекции найдите переднюю часть большеберцовой кости или сухожилие TA, видимое через кожу на боковой стороне голени, и отметьте верхний конец мышцы TA.Затем вставьте иглу 30-го калибра, установленную на 50-микролитровом микрошприце, в мышцу под неглубоким углом в пять градусов на один-два миллиметра выше миотендинозного соединения, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы. Нажмите на поршень, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы доставить 50 микролитров плазмидного раствора в мышцу. Мышца должна набухать.Установите таймер на одну минуту и измерьте толщину ноги в мышце ТА, затем установите электроды суппорта на измеренную толщину. Затем установите напряжение электропоратора на 12,5 вольт на миллиметр. Через одну минуту поместите электроды суппорта близко вокруг нижней конечности, не будучи чрезмерно плотными, чтобы подать пять импульсов квадратной волны с длительностью 20 миллисекунд и интервалами 200 миллисекунд.Мышца должна дергаться с каждым импульсом. Повторите процедуру с другой конечностью, используя контрольный плазмидный вектор. Когда это будет сделано, извлеките мышь из носового конуса и дайте мыши восстановиться на грелке, установленной на 37 градусов по Цельсию.После выздоровления верните мышь в клетку. Когда мышь находится в положении лежа, найдите передний гребень большеберцовой кости визуально и через мягкое сердцебиение. Используйте скальпель, чтобы сделать неглубокий разрез через кожу на боковой стороне переднего гребня большеберцовой кости на пять миллиметров ниже колена на два миллиметра выше миотендинозного соединения ТА.С помощью мелких ножниц тупо рассекают фасцию, обнажая мышцу ТА, а затем аккуратно отделяют мышцу ТА от большеберцовой кости, потянув мышцу, чтобы выявить разгибатель digitorum longus или EDL. Держите ТА чистым от EDL во время процедуры, используя небольшие изогнутые щипцы. Вставьте иглу 30-го калибра в EDL продольно, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы, и введите 10 микролитров плазмидного раствора, как показано ранее.Мышца EDL должна набухать. Измерьте толщину ножки в EDL и установите электроды суппорта на измеренную толщину, чтобы доставить пять импульсов квадратной волны, как объяснялось ранее. Когда это будет сделано, закройте разрез одноразовыми 4-0 нерассасывающимися нейлоновыми швами.Позже извлеките мышь из носового конуса и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 градусов цельсия. Введите соответствующий подкожный анальгетик сразу после операции и через 12-24 часа после операции. После выздоровления верните мышь в домашнюю клетку.После инъекции и электропорации плазмиды pcDNA3-EGFP в мышцах ТА и ЭДЛ наблюдалась экспрессия GFP, указывающая на поглощение ДНК в мышечных волокнах. При изображении при меньшем увеличении эффективность трансфекции мышц EDL может быть визуализирована через появление зеленых волокон по сравнению с черными волокнами. Введенные и электропорированные EDL имели аналогичные тетанические реакции при 100 Гц по сравнению с контрольными неинъекционными или электропорированными мышцами.Введенный и электропорированный EDL, тетаническая мышечная сила, удельная тетаническая мышечная сила, время до пикового напряжения и половинное время релаксации не были скомпрометированы по сравнению с нетронутым контролем. Важно точно определить мышцу, подлежащую инъекции, и эффективно доставить плазмидный раствор. С помощью этого протокола может быть проведен ряд гистологических и биохимических измерений.Может быть проведена клеточная локализация целевого белка, нокдаун гена-мишени, транскрипционные репортеры и массив окрашивания тканей. Этот метод был использован для выявления широкого спектра изменений в молекулярной сигнализации в мышцах во время физиологических и патофизиологических условий. Исследование сократимости мышц после переноса генов возможно с использованием этой техники.

electroporation-of-plasmid-dna-into-mouse-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Мы описываем подробные процедуры для эффективной трансфекции ДНК плазмиды в волокнах мышц стопы живых мышах электропорации и последующей визуализации экспрессии белка с помощью флуоресцентной микроскопии.

Трансфекция ДНК млекопитающих скелетных мышц использованием В Vivo Электропорация

Это видео демонстрирует доставку плазмидной ДНК в нейронные клетки мозжечка мышиных эмбрионов с помощью внутриутробной электропорации. Этот метод полезен для понимания функции генов in vivo в нормальном развитии мозга и изменений в экспрессии генов нейронных клеток во время прогрессирования опухоли.

Внутриутробная электропорация на основе доставки генов: метод введения плазмидной ДНК в эмбриональные клетки мозжечка мышиных эмбрионов

Пиальных поверхности зона является уникальной предшественников в ЦНС, что уделяется все большее внимание. При этом мы подробно способ быстрого генетической манипуляции этой зоны предшественников с использованием модифицированного метода электропорации. Эта процедура может быть использована для клеточных и молекулярных исследований клеточных линий и сигнальных путей, участвующих в дифференцировке клеток и выяснить судьбу и свойства дочерние клетки.

Неонатальный пиальных поверхности Электропорацию

В этой статье описывается микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях, как техника трансфекции для яичек мышиных клеток для изучения уникальных процессы сперматогенеза. Представленный протокол включает этапы подготовки стеклянной капиллярной, микроинъекции через выводного протока, и трансфекции путем электропорации.

В Vivo микроинъекции и электропорации мыши яичка

Этот протокол использует электропорацию для введения и экспрессии флуоресцентно меченых белков в мышечных волокнах мыши. После восстановления после электропорации волокна изолируются. Затем отдельные волокна визуализируются с помощью конфокальной микроскопии с высоким разрешением для визуализации структуры мышц.

ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон

Мы опишем новый метод для доставки плазмида ДНК в клетки мыши мочевого пузыря в естественных условиях через катетеризация уретры и электропорации urothelial. Она предлагает быстрый и удобный способ для генерации автохтонные мыши модели заболеваний мочевого пузыря.

Новый метод доставки ДНК плазмиды мыши Уротелий мочевого пузыря путем электропорации

Этот протокол описывает микроинъекцию и электропорацию in vivo для регионально ограниченного CRISPR-опосредованного редактирования генома в яйцеводе мыши.

Соматические геномно-инженерные модели мышей с использованием микроинъекций и электропорации in vivo

Функциональная сайт-направленная флуорометрия — это метод изучения движений белковых доменов в режиме реального времени. Модификация этого метода для его применения в нативных клетках теперь позволяет обнаруживать и отслеживать движения одного датчика напряжения из потенциал-зависимых каналов Ca2+ в изолированных волокнах скелетных мышц мышей.

Функциональная сайт-направленная флуорометрия в нативных клетках для изучения возбудимости скелетных мышц

Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе электропорацию in vivo и денервацию мышцы, поднимающей длинный краниальный клапан (LAL). Эта процедура позволяет изучить потенциальную роль мышечных белков в регенерации нервно-мышечного синапса.

Комбинированная электропорация in vivo и кратковременная реиннервация скелетной мышцы Cranial levator auris longus

В этой статье мы представляем подход к генной терапии, который доставляет хитозан с покрытием ABE непосредственно в костный мозг путем внутрикостной инъекции.

Улучшенная доставка и экспрессия генов с помощью внутрикостного введения наночастиц хитозана, инкапсулированных плазмид редактора адениновых оснований

Изучите электропорацию плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши для исследования физиологии мышц. Этот метод обеспечивает эффективную доставку генов без нарушения сократимости мышц.

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши

Больше видео