Измерение динамики нейропептидов in vivo с временным разрешением с помощью емкостного иммунозонда в сердце свиней

Это первый случай, когда был разработан метод измерения с временным разрешением уровней пептидных передатчиков in vivo. Мы можем измерять уровни пептидных передатчиков в отдельных субъектах и дискретных местах с помощью анализа, близкого к реальному времени. Во-первых, вырежьте 25-сантиметровую длину платиновой проволоки с перфторалкокси-покрытием.

Затем, используя скальпель, снимите примерно пять миллиметров перфторалкокси-покрытия с одного конца, стараясь не разрезать на платиновую проволоку. Теперь вставьте зачищенный конец платинового провода в позолоченный одномиллиметровый контакт разъема. Затем, используя плоскогубцы, обжимаем контактные зубья разъема вокруг зачищенного конца платинового провода и паяем платиновый провод к позолоченному контакту разъема.

Далее готовят раствор дофамина, добавляя 50 миллиграммов гидрохлорида дофамина в 50 миллилитрах 10-миллимолярного PBS с рН шесть и перемешивают путем перемешивания. После полного растворения дофамина поместите наконечник платиновой проволоки в сосуд, содержащий свежеприготовленный дофамин СДБ. Подключите дисковый электрод хлорида серебра к заземляющему каналу в головной ступени.

Затем поместите диск хлорида серебра в сосуд, содержащий PBS, дополненный дофамином, и платиновую проволоку. Прежде чем идти дальше, подключите проволочный шунт к опорным каналам головной ступени. Откройте интерактивное программное обеспечение для сбора данных и установите протокол потенциала команды электроосаждения пилообразного электроосаждения, установив начальный потенциал на минус 0,6 вольта, конечный потенциал на 0,65 вольта, скорость сканирования на 0,04 вольта в секунду и продолжительность осаждения на 420 секунд.

После завершения осаждения полидофамина удалите гранулу хлорида серебра и наконечник платиновой проволоки из сосуда. Поместите наконечник проволоки в микротрубку, содержащую PBS рН 7,4, на две-пять минут и убедитесь, что наконечник провода не соприкасается с боковыми или нижними сторонами микропробирки. Затем готовят раствор антител, комбинируя интересующее антитело с PBS рН 7,4 в соотношении 1:20 в сосуде соответствующего размера.

Затем замочите полидофаминовый осажденный наконечник платинового электрода в растворе антител в течение двух часов при комнатной температуре, гарантируя, что наконечник платиновой проволоки подвешен в растворе и не покоится на внутренней поверхности микротрубки. Поместите функциональный наконечник емкостного иммунозонда в проточную камеру, заботясь о том, чтобы не потревожить кончик электрода каким-либо образом, так как это может повредить сенсорный наконечник зонда. Перед первым экспериментальным испытанием выполните стандартный прогон TBS для кондициации емкостного иммунозондового зонда, а для протокола напряжения установите потенциал положительного шага на 110 милливольт, отрицательный потенциал шага до минус пяти милливольт, продолжительность шага 20 миллисекунд и продолжительность сбора до 600 секунд.

Затем создайте интересующий пептидный раствор, используя тот же TBS для поддержания состава суперфузата. Настройте многообразную систему, в которой суперфузат можно переключать между TBS и TBS, дополненным пептидами. Используйте стандартные параметры TBS и настройте протокол сбора данных пептидного зондирования, установив продолжительность сбора 360 секунд.

Перед осаждением полидофамина проденьте открытый наконечник электрода из платиновой проволоки через подкожную иглу 22-го калибра, оставив примерно два миллиметра за кончиком иглы. Используйте щипцы и осторожно согните кончик электрода из платиновой проволоки, чтобы создать колючку, которая свисает с конца подкожной иглы. Осторожно извлеките иглу из колючего наконечника, оставив достаточно проволоки для помещения в сосуд без контакта иглы с жидкостью, и приступайте к отложению дофамина, как показано ранее.

Теперь промойте колючий наконечник зонда PBS и поместите его в раствор антител. Затем аккуратно извлеките функционализированный наконечник из PBS. Переместите иглу для подкожных инъекций к колючему емкостному иммунозонду и аккуратно имплантируйте его в интересующую область, прежде чем подключать золотой соединительный штифт к головной стадии.

После имплантации извлеките подкожную иглу, оставив электрод на месте. Положительный шаг в командном потенциале измеряет ток впрыска, необходимый для зажима напряжения зонда, и позволяет измерять емкостный ток. Шаг отрицательного командного потенциала очищает связанный пептид от антитела посредством электростатического отталкивания.

Форма сигнала команды ступенчатой функции изображала итеративное обнаружение и количественную оценку пептида с временным разрешением. Нижняя трассировка представляла командный потенциал и результирующий ток при переливании зонда в TBS. Уравновешенный емкостный иммунозонд показал меньший начальный распад и стабильный исходный уровень в течение шести минут.

Поток нейропептида Y в проточную камеру увеличивал емкостные токи по сравнению с исходной линией. Емкостные иммунозондовые токи, измеренные с помощью нейропептидного зонда, функционализированного антителом Y, показали зависящий от концентрации сигнал, чувствительный к нейропептиду с низким содержанием пикомоле Y Для калибровки стандартную кривую измеряли для всех тестируемых концентраций. Стимуляция двустороннего звездчатого ганглия показала повышенный уровень нейропептида Y при совместном построении с отрицательными контрольными емкостными токами.

Высвобождение норадреналина, измеренное при стимуляции звездчатой, показало синхронное высвобождение с нейропептидом Y, что согласуется с вызванной симпатической реакцией. Разработка этих методов может обеспечить интраоперационное считывание ключевых модуляторов сердечной деятельности, обеспечивая тем самым потенциальное быстрое терапевтическое или интервенционное руководство. Метод, представленный здесь, специфичен для сердечно-сосудистого развертывания, однако сам метод подходит для других физиологических условий, таких как моча, скелетные мышцы, почки, жировая ткань и т. Д.