Определение сродства связывания (K_D) радиомеченных антител к обездвиженным антигенам

Этот метод может определить сродство связывания радиомаркированного антитела к его антигену. Он также будет измерять специфику связывания. Основным преимуществом этого простого метода является специфическая характеристика сродства связывания только радиомеченого антитела без помех от неконъюгированного родительского антитела.

Этот метод количественно подтверждает способность радиомаркированного антитела связываться со своей мишенью. Это важно для применения в ядерной визуализации и в ядерной терапии при различных заболеваниях. Продемонстрировать процедуру будет Эрика Белицки, аспирант из моей лаборатории.

Для начала подготовьте буфер иммобилизации, добавив 191 миллиграмм бикарбоната натрия и 23,9 миллиграмма карбоната натрия в 50-миллилитровую коническую трубку. Затем добавьте 40 миллилитров 18-мегаомной воды и растворите путем вихря. Теперь отрегулируйте pH до 9,0, прежде чем довести общий объем до 50 миллилитров.

Затем подготовьте 200 миллилитров промывочного буфера, добавив 200 миллилитров PBS и 100 микролитров Tween 20 в бутылку с 250 миллилитрами. Также готовят 50 миллилитров связывающего буфера, добавляя 50 миллиграммов BSA и 25 микролитров Tween от 20 до 50 миллилитров PBS и смешивают путем вихря. Добавьте 1,5 грамма BSA к 50 миллилитрам PBS, чтобы подготовить блокирующий буфер и аккуратно перемешать.

Разбавляют антиген в иммобилизационном буфере. Затем возьмите бьющуюся плиту с плоским дном на 96 лунок и добавьте 100 микролитров антигена на дно каждой скважины из 24 скважин в массиве восемь на три. Накройте пластину уплотнительной лентой и высиживайте при четырех градусах Цельсия в течение ночи.

На следующий день трижды вымойте тарелку с помощью промывочного буфера. Быстро переверните пластину в раковине, чтобы избавиться от жидкости, и постучите пластиной по куче бумажных полотенец, чтобы удалить лишнюю жидкость. Затем к скважинам, содержащим антиген, добавляют 300 микролитров промывочного буфера на скважину с помощью многоканальной пипетки.

Добавьте 300 микролитров блокирующего буфера на скважину как в скважины с 24 антигенным покрытием, так и в 24 пустые скважины из 96 скважин. Затем инкубируйте пластину в течение одного часа при температуре окружающей среды и трижды промывайте каждую лунку пластины 300 микролитрами промывочного буфера. Производят трехкратное последовательное разведение радиомеченого антитела в буфере связывания в течение восьми рядов, обозначенных на пластине как от А до Н.

Во-первых, рассчитают объем запаса радиомеченного антитела, необходимого для получения 1,2-миллилитра раствора первой концентрации. Затем добавляют 800 микролитров связывающего буфера к микроцентрифужным трубкам с маркировкой от B до H и добавляют необходимый объем связывающего буфера к микроцентрифужной трубке с маркировкой A.Добавьте расчетный объем запаса радиомаркированного антитела к трубке A и осторожно вихрь. Затем раскрутите вниз, используя мини-микроцентрифугу, чтобы собрать всю жидкость на дне трубки.

Затем добавьте 400 микролитров жидкости из двух А в трубку Б. После вихря раскрутите ее вниз с помощью мини-микроцентрифуги. Аналогично добавляют раствор из трубки B в трубку C, C в D, до трубки H.Добавьте 100 микролитров каждого разведения на лунку в три лунки, иммобилизованные антигеном, и три лунки, заблокированные только BSA. Теперь добавьте 100 микролитров каждого разведения к микроцентрифужным лампам, помеченным стандартом A до стандарта H, и сохраните эти трубки в качестве стандартов антител с радиомаркированной маркировкой для анализа в гамма-счетчике.

Инкубируйте пластину в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия с нежным раскачиванием. Маркировка микроцентрифужных трубок для каждой скважины так, как описано в рукописи. Аспирировать радиомеченое антитело из скважин 96-луночной пластины с помощью вакуумного аспиратора.

Теперь, используя многоканальную пипетку, добавьте в каждую скважину 300 микролитров промывочного буфера. Аспирируйте буфер для стирки и повторите стирку еще четыре раза. Разбейте колодцы на соответствующие микроцентрифужные трубы.

Подсчитайте радиоактивность в лампах с антигеном, помеченным как H1, H2, H3, H3 до A1, A2, A3, а затем с BSA только с маркировкой H4, H5, H6, до A4, A5, A6 с помощью гамма-счетчика. Радиомаркированный амивантамаб показал специфическое связывание с белками EGFR и cMET. Аналогичное сродство связывания также сохранялось однорукими радиомеченными фабами, связанными с белками EGFR и cMET.

Графики связывания насыщенности показали, что когда концентрации меченых радиоактивными антителами были слишком низкими, насыщение не достигалось, о чем свидетельствует линейная кривая. Концентрации радиомеченных антител, которые были слишком высокими, приводили к насыщению без отчетливого логарифмического роста, как показывает горизонтальное плато. Также наблюдалось высокое неспецифическое связывание из-за высоких концентраций радиомеченных антител.

Эта процедура может потребовать нескольких попыток оптимизировать диапазон концентраций для каждого конкретного радиомаркированного антитела. Используйте данные из отрицательных результатов, чтобы помочь в разработке будущих экспериментов. Как только сродство связывания известно, его можно использовать в качестве ориентира для других анализов in vitro как часть характеристики радиомеченого антитела.