Разработка моделей Drosophila melanogaster для визуализации и оптогенетического контроля сердечной функции
25 августа 2022 г.
Настоящий протокол описывает генерацию Drosophila melanogaster , экспрессирующего eNpHR2.0 или ReaChR опсины в сердце для визуализации OCT и оптогенетической кардиостимуляции. Представлены подробные инструкции по визуализации Drosophila OCT и модуляции сердцебиения, включая моделирование восстановительной остановки сердца, брадикардии и тахикардии у живых животных на разных стадиях развития.
В протоколе представлены модели дрозофилы, где функцию сердца можно охарактеризовать и контролировать с помощью света. Это позволяет исследователям изучать сердечные заболевания человека у дрозофилы с использованием интактных животных. Этот метод может надежно достичь неинвазивной визуализации OCT и оптогенетического контроля функции сердца Drosophila.
Обладает высокой эффективностью и качеством. Оптогенетическое кардиостимуляция потенциально может быть альтернативой электрическому кардиостимуляции в качестве терапии для лечения аритмических расстройств. Oct-визуализация и оптогенетический темп могут быть распространены на другие модельные системы, такие как органоиды сердца, рыбы данио и эмбриональное горло и сердце.
Для начала объедините пять рук GAL4 над TM6 двустворчатой девственной самкой и двумя-тремя самцами мух из UAS Ops и Stock на флакон. На следующий день приготовьте полуопределенную пищу в соответствии с инструкциями Bloomington Drosophila Stock Center, добавив 5,14 грамма на 100 миллилитров сахарозы в контейнер на горячей плите. Затем охладите его до 60 градусов Цельсия при постоянном перемешивании.
Затем приготовьте узкие флаконы, добавив в каждый флакон 50 микролитров 100 миллимолярного полностью транс-раствора этанола сетчатки. Используйте серологическую пипетку, чтобы утилизировать пять миллилитров корма мухи на узкую мерзкую муху. После вихрения на максимальной скорости в течение 10 секунд заткните эти флаконы и заверните их в темную ткань, чтобы защитить их от света.
На следующий день перенесите мух, неуклонно откладывающих яйца, во флаконы с полностью транс-сетчаточным этанолом, содержащим пищу. Защитите стеллажи флаконами от света. Через 24-48 часов, в зависимости от количества отложенных яиц, откажитесь от родителей, чтобы предотвратить перенаселение флаконов.
Затем соберите потомство нетуби для визуализации сердца. Выберите из флакона вариант UAS личинку GAL4 или куколку, положите ее на салфетку и аккуратно вытрите носитель с поверхности тела с помощью малярной кисти. Подготовьте слайд микроскопа с небольшим кусочком двусторонней ленты посередине.
Затем аккуратно поместите личинку или куколку на поверхность ленты спинной стороной вверх и перпендикулярно длинной стороне слайда с помощью щетки или тонкого пинцета. Приложите мягкое давление, чтобы прикрепить личинку или куколку к поверхности ленты. Теперь настройте слайд на стадии визуализации с личинкой или куколкой вниз и включите оптическую когерентную томографию или источник света OCT с помощью программного обеспечения для управления лазером.
Откройте специально записанное программное обеспечение управления центром развертывания Office в спектральном домене. Затем нажмите на окно предварительного просмотра. Затем задайте параметры сканирования в программном обеспечении OCT спектральной области.
Используйте микроманипуляторы для управления стадией образца, чтобы сфокусировать сердце мухи. Отрегулируйте фокусное положение, чтобы свести к минимуму отражение света от поверхности мушки. Кроме того, рассмотрите возможность нанесения минерального масла на поверхность личинки или куколки, чтобы свести к минимуму отражение.
Затем задайте параметры сканирования для получения изображения OCT в режиме M и получите пять наборов контрольных данных без импульсов стимуляции красным светом для расчета частоты сердечных сокращений в состоянии покоя. Проектирование светового импульса для стимуляции темпа в пользовательском программном обеспечении управления OCT. Для этого нажмите на вкладки настроек и добавьте разработанные последовательности световых импульсов для управления частотой импульса, шириной импульса, длительностью стимуляции и временем ожидания в соответствии с различными протоколами стимуляции.
Затем откройте программное обеспечение контроллера света, чтобы генерировать импульсы красного света. Выберите импульсный режим в выборе режима. Дважды щелкните рисунок для настроек профиля импульса и выберите режим следования.
Держите интенсивность выключения на нулевом уровне и установите процент интенсивности при расчете фактической плотности мощности. Получите видео в режиме M бьющегося сердца дрозофилы со световой стимуляцией, нажав на Получить в программном обеспечении OCT Control. Записывайте вспышки красного света вниз по сердцу мухи во время получения изображений.
Обратите внимание, что для управления функцией сердца мухи требуются различные настройки темпа с помощью моделей с красным смещением ченнелордопсина и NPHR. Откройте специально разработанное программное обеспечение для сегментации сердца мухи и нажмите на выбранный файл. Затем выберите файл для анализа в графическом интерфейсе пользователя.
Введите вертикальные и горизонтальные границы области сердца в пикселях в верхних текстовых полях. Нажмите на изменение размера. Используя ползунок внизу, убедитесь, что вся область сердца видна и что она заполняет всю коробку для всей коллекции.
После нажатия на вкладку прогнозирования программа пройдет через каждый фрагмент в коллекции и выберет область сердца примерно через три минуты. Как только прогноз будет завершен, нажмите на график HR, чтобы отобразить график области сердца с течением времени в новом окне. Выберите правильные области пика или долины, выберите пульс, а затем вкладки HR, чтобы сгенерировать окончательную цифру.
Функциональные параметры будут одновременно сохранены в CSV-файлах. Тканевая специфичность ручного драйвера GAL4 была проверена путем визуализации экспрессии зеленого флуоресцентного белка. Типичные изображения OCT поперечного сечения личинок и куколок показаны здесь.
Чтобы имитировать различные сердечные заболевания, были разработаны четыре типа световых импульсов. Один импульс, длившийся 10 секунд после пяти секунд ожидания, вызвал восстановительную остановку сердца. Для кардиостимуляции на частотах ниже частоты сердечных сокращений в состоянии покоя использовались две последовательности световых импульсов с частотами темпа, равными половине частоты сердечных сокращений в состоянии покоя, и одной четверти частоты сердечных сокращений в состоянии покоя продолжительностью восемь секунд со временем ожидания в шесть секунд между ними.
Схема стимуляции для увеличения частоты сердечных сокращений за счет активации красного каналародопсина состояла из трех последовательностей световых импульсов. Снижение частоты сердечных сокращений после световых сигналов привело к замедлению сердечного ритма, который имитирует личинку и куколку. Серия из трех световых импульсных поездов на разных частотах стимуляции была применена к личинкам, а сердца куколок ясно показали увеличение частоты сердечных сокращений после световых импульсов.
Подготовка к выбору правильного потомства, монтаж образца и процедура визуализации имеют важное значение. Мы надеемся перенести технологию оптогенетического кардиостимуляции на более крупные модели животных, изучить болезни сердца млекопитающих и изучить новые терапевтические подходы к лечению аритмии.
Обзор
Этот протокол описывает создание Drosophila melanogaster, экспрессирующих опсины для визуализации оптической когерентной томографии (ОКТ) и оптогенетического сердечного стимулятора. Он предоставляет детальные методы для модуляции функции сердца у живых животных, включая моделирование различных сердечных состояний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Оптогенетика
- Кардиоваскулярные исследования
Фон
- Модели Drosophila позволяют изучать функцию сердца и заболевания.
- Оптогенетические методы обеспечивают точный контроль за активностью сердца.
- ОКТ-визуализация предоставляет неинвазивное наблюдение за динамикой сердца.
- Этот подход может быть распространен на другие модельные системы.
Цель исследования
- Разработать метод для неинвазивного исследования и контроля функции сердца у Drosophila.
- Моделировать сердечные состояния, такие как брадикардия и тахикардия.
- Исследовать оптогенетическое стимуляторное воздействие как потенциальную терапию аритмий.
Используемые методы
- Создание Drosophila, экспрессирующих опсины.
- Приготовление пищи, содержащей all-trans ретиналь для личинок.
- Оптическая когерентная томография (ОКТ) для визуализации функции сердца.
- Разработка последовательностей световых импульсов для оптогенетического стимулятора.
Основные результаты
- Успешное исследование функции сердца Drosophila с использованием ОКТ.
- Демонстрация оптогенетического контроля за частотой сердечных сокращений.
- Возможность моделирования различных сердечных состояний с помощью световой стимуляции.
- Потенциал применения в более крупных модельных животных.
Выводы
- Этот метод предоставляет надежный подход для исследования функции сердца у Drosophila.
- Оптогенетическая стимуляция может служить альтернативой традиционным методам стимуляции.
- Будущие исследования могут расширить этот технологический подход на млекопитающие модели.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Non-invasive optogenetic control and imaging of cardiac function in Drosophila melanogaster enables high-throughput, genetically tractable modeling of cardiac phenotypes relevant to human disease. This platform supports early-stage mechanistic de-risking and target validation for cardiac drug discovery by providing quantitative, reproducible readouts in a whole-organism context. Integration of OCT imaging with optogenetic pacing advances predictive confidence and translational continuity from discovery biology to preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cardiac function and arrhythmia mechanisms in a genetically defined, in vivo system.
- Supports functional target validation by linking genetic perturbations to quantitative cardiac phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through precise, reversible modulation of heart activity.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, scalable platform for quantitative assessment of cardiac responses to genetic or pharmacological interventions.
- Delivers reproducible, high-content imaging and optogenetic stimulation outputs for assay standardization.
- Enables screening readiness for compounds affecting cardiac rhythm or contractility in a whole-organism context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns disease-relevant cardiac phenotypes in Drosophila with translational biomarker strategies.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by modeling arrhythmia and bradycardia in vivo.
- Provides predictive de-risking for cardiac safety and efficacy prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven cardiac studies, quantitative phenotyping, and assay development in a genetically tractable model. It is positioned for integration from target validation through lead identification and preclinical risk assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for cardiac targets using optogenetic and imaging readouts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screening in a whole-organism system.
- Analytics: Provides high-resolution, time-resolved measurements of heart function for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of Drosophila cardiac phenotypes with preclinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for cardiac research across multiple genetic backgrounds and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Standardizes non-invasive, high-throughput cardiac phenotyping and optogenetic control workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early risk assessment of cardiac liabilities.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs with quantitative, translational data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, optogenetics, and OCT imaging.
- Needs access to custom imaging and light stimulation instrumentation with integrated analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptation to other model systems (e.g., organoids, zebrafish) may require protocol optimization.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise genetic control.
