Фотодинамический подход к изучению функции разрыва внутриклеточных везикул
17 марта 2023 г.
AlPcS-2a-опосредованная хромофорная лазерная инактивация (CALI) является мощным инструментом для изучения пространственно-временного повреждения внутриклеточных везикул (IV) в живых клетках.
Эндоцитоз везикулы в цитоплазию приводит к образованию внутриклеточных везикул. Пермеабилизация везикулы активирует различные сигнальные пути. Хромофорная лазерная инактивация используется для изучения последствий разрыва внутриклеточных везикул.
Пространственный и временной контроль субклеточного повреждения внутриклеточных везикул может быть достигнут путем регулировки состояния стояния и светового освещения. Для начала поддерживайте культуру клеток HeLa в DMEM с добавлением 10% FBS. После промывки клеток PBS трипсинизируйте клетки.
Затем ресуспендируют клетки в DMEM с добавлением 10% FBS. Разведите 300 нанограмм плазмиды Gal3-GFP в 25 микролитрах восстановленной сывороточной среды. Затем добавьте 0,6 микролитра реактива P3000.
И аккуратно перемешивают, после чего перемешивают раствор. Разведите 0,45 микролитра реактива Липофектамин 3000 в 25 микролитрах восстановленной сывороточной среды и аккуратно перемешайте. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем смешайте разбавленную ДНК и разведенный Lipofectamine 3000 и выдержите 10 минут при комнатной температуре. После смешивания смеси ДНК липофектамина 300 000 суспендированных клеток HeLa и 200 микролитров DMEM с 10% FBS засевают клетки в центральную стеклянную область 35-миллиметровой стеклянной пуговицы. Чтобы обеспечить прикрепление клеток, инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, снабженном 5% углекислым газом, в течение не менее четырех часов.
Разбавьте AlPcS2a в DMEM с добавлением 10% FBS, чтобы получить один микромолярный раствор AlPcS2a. Предварительно подогрейте среду, содержащую AlPcS2a, на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия и замените питательную среду средой, содержащей AlPcS2a. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, снабженном 5% углекислого газа в течение ночи.
На следующий день дважды промойте клетки PBS, чтобы удалить внеклеточный AlPcS2a после замены среды свежей средой. Инкубируйте при температуре 37 градусов по Цельсию в течение четырех часов, чтобы остаточный краситель вдоль эндоцитарного пути накапливался в лизосомах. Чтобы манипулировать отдельными клетками, повреждая лизосомы, поместите культуральную чашку на столик конфокального микроскопа.
Используйте 488-нанометровый и 561-нанометровый лазеры для возбуждения GFP и AlPcS2a соответственно. Обведите квадратную область размером пять на пять микрометров, представляющую интерес, на везикулах, меченных AlPcS2a, которые выбраны для повреждения. Затем импульс осветит интересующую область 633-нанометровым лазером мощностью 0,21 милливатта, или 70 повторов.
Следите за образованием Gal3 puncta как индикатора пермеабилизации лизосомальной мембраны. Лизосомальное окрашивание AlPcS2a в клетках HeLa проводили с использованием коммерчески доступных маркеров и положительно окрашивали зеленым флуоресцентным красителем. Лизосомы в клетках HeLa, экспрессируемых TagRFP-Galectin3, окрашивали AlPcS2a.
С последующей фокусировкой освещения ближним инфракрасным светом результаты показывают, что хромофорная лазерная инактивация на основе AlPcS2a смогла контролировать локальный лизосомальный разрыв в интересующей области, оставляя остальные лизосомы нетронутыми. Этот шаг важен, потому что время инкубации определит стоящие эндосомы или лизосомы. Например, люди могут определить размер по выделению мембранно-непроницаемого красителя.
Также можно использовать pH-чувствительные красители, такие как декстран FITC, для различий эндосом и лизосом. Этот метод полезен для запуска последующих эффектов разрыва мембраны внутриклеточных везикул. И в различных ситуациях есть побочные эффекты.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Метод хромофор-опосредованной лазерной инактивации (CALI) с использованием AlPcS 2a применяется для исследования пространственно-временного повреждения внутриклеточных везикул в живых клетках. Данная методика позволяет осуществлять точный контроль над повреждениями на субклеточном уровне, что дает возможность изучить последствия разрыва везикул.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейробиология
- Визуализация живых клеток
Теоретические основы
- Эндоцитоз приводит к образованию внутриклеточных везикул.
- Пермеабилизация везикул активирует различные сигнальные пути.
- CALI — это метод изучения эффектов разрыва везикул.
- Пространственный и временной контроль осуществляется посредством светового облучения.
Цель исследования
- Изучить динамику повреждения внутриклеточных везикул.
- Понять сигнальные пути, активируемые разрывом везикул.
- Совершенствовать методы изучения взаимодействий в живых клетках.
Используемые методы
- Культивирование клеток HeLa в среде DMEM с 10% FBS.
- Промывка клеток PBS перед проведением эксперимента.
- Трипсинизация клеток для последующего анализа.
- Применение метода CALI для индукции локального повреждения.
Основные результаты
- Продемонстрирован эффективный контроль над повреждением везикул.
- Идентифицированы ключевые сигнальные пути, активируемые после разрыва.
- Подтверждена возможность использования CALI в исследованиях живых клеток.
- Получены новые данные о механизмах функционирования везикул.
Выводы
- CALI является ценным инструментом для изучения внутриклеточной динамики.
- Полученные результаты расширяют понимание сигналинга, связанного с везикулами.
- В будущих исследованиях эти методы могут быть использованы для более глубокого анализа.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Лазерная инактивация с помощью хромофоров (CALI) обеспечивает точную пространственно-временную индукцию разрыва внутриклеточных везикул, предоставляя контролируемую систему для изучения процессов пермеабилизации мембран. Данный подход способствует снижению механистических рисков и валидации мишеней, позволяя селективно манипулировать целостностью эндосом и лизосом в живых клетках и проводить их мониторинг. Метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет установления связи между разрывом везикул, последующей передачей сигналов и привлечением молекул.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать целостность мембраны везикул и ее роль в сигнальных путях.
- Обеспечивает функциональную валидацию привлечения гликан-связывающих белков, таких как galectin-3, при разрыве везикул.
- Способствует механистическому снижению рисков путем изоляции эффектов направленной пермеабилизации органелл.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает платформу для разработки количественных методов анализа на основе визуализации для мониторинга разрыва везикул и привлечения молекул.
- Поддерживает стандартизацию анализа за счет контролируемой локальной индукции пермеабилизации мембран.
- Позволяет воспроизводимо оценивать влияние соединений на стабильность эндосом и лизосом.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний, в которых целостность везикул влияет на клеточную сигнализацию и патологию.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя изучать последующие эффекты разрыва везикул.
- Облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков, предоставляя понимание механизмов клеточного ответа.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный фотодинамический подход интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, позволяя осуществлять направленное манипулирование событиями разрыва везикул и их регистрацию на основе выдвинутых гипотез.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезы о роли пермеабилизации везикул в передаче сигналов и привлечении белков.
- Скрининг: обеспечивает количественные и воспроизводимые результаты визуализации для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет измеряемые конечные точки, такие как образование пунктат галектина-3 и высвобождение красителя, для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывают механистические выводы с релевантными моделями заболеваний, при которых задействован разрыв везикул.
- Корпоративное повторное использование: предлагает универсальную модульную платформу для изучения динамики мембран в различных типах клеток и условиях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность в исследованиях сигнализации, связанной с везикулами.
- Практическая ценность: Стандартизирует индукцию и измерение разрыва везикул для получения воспроизводимых результатов.
- Стратегическая ценность: Обосновывает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем уточнения функциональных последствий пермеабилизации мембран.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней и путей, зависящих от целостности везикул, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток и фотодинамического манипулирования.
- Необходим доступ к инфраструктуре конфокальной микроскопии и лазерного освещения.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов визуализации и анализа.
- Метод адаптируемы к различным клеточным линиям и маркерам органелл при использовании соответствующих контролей.
- Воспроизводимость зависит от точной калибровки параметров лазера и концентраций красителей.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Transfection and AlPcS2a Staining
3:00
Sample Imaging and Light Illumination
3:47
Results: AlPcS2a-Mediated Chromophore‐Assisted Laser Inactivation for Studying patiotemporal Damage of Intracellular Vesicles in Live Cells
4:25
Conclusion
