Генетический скрининг для идентификации мультикопийных супрессоров в Schizosaccharomyces pombe

Супрессорные экраны идентифицируют генетические взаимодействия, которые проливают свет на функции интересующего гена, а также на пути и биологические процессы, в которых они могут быть вовлечены in vivo. Этот метод может идентифицировать генетическую связь между двумя генными продуктами, которая, возможно, не была продемонстрирована с использованием других подходов. Результаты таких скринингов в дрожжах могут быть распространены на организмы с высоким содержанием эукариот, поскольку большинство фундаментальных биологических путей и процессов сохраняются на протяжении всей эволюции.

Успех схемы зависит от наличия, высокого качества и высокой эффективности ее превращения в дрожжевые клетки. Таким образом, протокол трансформации с плазмидой перед Grow штамма делеции Schizosaccharomyces pombe ell1 при 32 градусах Цельсия на YE средней пластине. Возьмите петлю, полную мутантного штамма ell1 с пластины, привите пять миллилитров дополненной среды YE, а затем высиживайте флакон, встряхиваясь при 32 градусах Цельсия в течение ночи.

После инкубации разбавляют культуру ночного роста в 100 миллилитрах свежей среды YE, содержащей желаемые добавки, чтобы достичь оптической плотности 0,3 при 600 нанометрах. Инкубируйте среду при 32 градусах Цельсия при встряхивании при 200-550 об/мин, пока оптическая плотность при 600 нанометрах не достигнет средней фазы. После деления 100 миллилитров культуры на две 50-миллилитровые центрифужные трубки гранулируют клетки в 4000 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре.

Как только супернатант будет выброшен, повторно суспендируйте гранулу клетки в одном миллилитре стерильной воды. Центрифугируйте и снова выбросьте супернатант, а затем повторно суспендируйте гранулу ячейки в одном миллилитре ацетата лития TE. Гранулируйте ячейку центрифугированием и повторно суспендируйте каждую ячейку гранулы в 250 микролитрах ацетата лития TE. Затем переведите 125 микролитров компетентных клеток в четыре различные стерильные микроцентрифужные трубки для последующих стадий трансформации. Отварите ДНК носителя из яичек лосося или спермы сельди в течение одной минуты и сразу же поместите трубку на лед.

Для каждой трансформации добавьте 10 микролитров одноцепочечной несущей ДНК в микроцентрифужную трубку, содержащую 125 микролитров компетентных клеток, и аккуратно перемешайте путем пипетирования. Впоследствии добавьте 50 микрограммов библиотеки кДНК Schizosaccharomyces pombe в трубку, содержащую компетентные клетки и смесь ДНК носителей. После инкубации трубки при комнатной температуре в течение 10 минут добавляют 260 микролитров раствора полиэтиленгликоля-ацетата лития и перемешивают путем пипетирования.

Инкубировать трубку, содержащую трансформационную смесь при 32 градусах Цельсия, в течение двух часов без встряхивания. Добавьте в пробирку 43 микролитра предварительно нагретого диметилсульфоксида и аккуратно перемешайте. Теперь подвергайте трубку тепловому удару при 42 градусах Цельсия в течение пяти минут.

Гранулируйте ячейки и выбрасывайте супернатант, как было показано ранее, а затем выбрасывайте остаточный раствор полиэтиленгликоля литий-ацетата TE. Повторно суспендируют клетки в 100 микролитрах стерильной воды и наносят их на одну пластину EMM2, содержащую необходимые добавки и 0,2 микрограмма на миллилитр 4-NQO. Затем позвольте колониям появиться на пластинах, инкубируя пластины при 32 градусах Цельсия в течение пяти-шести дней.

Для дальнейшего скрининга проводят полоску полученных колоний на той же средней пластине в присутствии 0,2 мкг на миллилитр 4-NQO. Для одного эксперимента по преобразованию библиотеки используйте 500 микролитров компетентных ячеек для преобразования и пластину 1 на 10-ю часть трансформационной смеси на пластине EMM2 с необходимыми добавками, не имеющими 4-NQO, чтобы рассчитать общее количество клонов библиотеки, полученных после преобразования, и экран для клонов-супрессоров. Добавьте от 100 до 200 микролитров стерильной воды в каждую лунку стерильной 96-луночной микротитровой пластины.

Используя стерильную зубочистку или наконечник микропипетки от 20 до 200 микролитров, выберите небольшое количество инокулята из каждой колонии, полученной после преобразования библиотеки кДНК, на пластине, содержащей 4-NQO. Добавьте инокулят из каждой из различных колоний в каждую лунку пластины, содержащей стерильную воду, и тщательно перемешайте. Нанесите три микролитра клеточной суспензии из каждой лунки на агаровые пластины EMM2 и добавьте соответствующие концентрации 4-NQO на пластины.

После выращивания клеток при 32 градусах Цельсия в течение трех-четырех дней определите колонии, которые показывают рост в разных концентрациях 4-NQO, как предполагаемые супрессоры. Для дальнейшей проверки супрессоров выращивают выбранные супрессоры и соответствующие контрольные штаммы в среде EMM2, содержащей 225 микрограммов на миллилитр аденина и урацила при 32 градусах Цельсия в течение ночи с встряхиванием. После окончания инкубации разводят клетки до оптической плотности 0,3 в свежей среде EMM2 и выращивают их при встряхивании при 32 градусах Цельсия до середины фазы бревна.

Обнаружение соответствующих последовательных разведений культур на пластинах EMM2 с необходимыми добавками, содержащими либо 0,4 микромолярного 4-NQO, либо 0,01% MMS. Для контроля определите штаммы на пластине EMM2 с необходимыми добавками, но без какого-либо агента, повреждающего ДНК. Инкубируйте пластины при 32 градусах Цельсия в течение трех-пяти дней, чтобы контролировать рост.

Обнаружите мутантные штаммы, преобразованные с помощью полноразмерного гена интереса или пустого вектора в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно, вместе с библиотечными трансформантами. Инокулируют одну колонию дрожжей в среде EMM2, содержащей 225 микрограммов на миллилитр аденина и урацила, и выращивают клетки при 32 градусах Цельсия в течение ночи с встряхиванием при 200-250 оборотах в минуту. В конце инкубации собирают 10 миллилитров культуры оптической плотности 0,5 путем центрифугирования в 4 000 раз G в течение двух минут при комнатной температуре.

Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 0,2 миллилитра лизисного буфера. Добавьте в микроцентрифужную трубку 0,2 миллилитра изоамилового спирта фенола хлороформа и 0,3 г промытых кислотой стеклянных шариков. Перемешайте, вихря трубку в течение двух минут, а затем высиживая на льду в течение одной минуты.

Центрифугируйте трубку в 10 000 раз G в течение 15 минут при комнатной температуре. Переложить верхний водный слой на свежую микроцентрифужную трубку и добавить 200 микролитров фенольного хлороформа изоамилового спирта. После центрифугирования снова по 10 000 G в течение 10 минут переложить верхний водный слой в свежий тюбик.

Затем добавьте в пробирку два объема 100% этанола и 1 на 10-й объем ацетата натрия и инкубируйте при минус 70 градусах Цельсия в течение одного часа. Осаждение ДНК центрифугированием при 10 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и удаление супернатанта. Вымойте гранулу ДНК 70% этанолом и высушите на воздухе при комнатной температуре.

Повторно суспендируйте ДНК в 20 микролитрах стерильной воды и используйте от трех до пяти микролитров плазмидной ДНК для преобразования компетентных клеток кишечной палочки. Используя стандартный протокол, трансформируйте изолированные плазмиды дрожжей в штамм Escherichia coli TOP10 и распределите клетки по пластинам LB с необходимыми антибиотиками. После выделения плазмиды из трансформантов Escherichia coli с использованием стандартного протокола щелочного лизиса следуйте соответствующим комбинациям ферментов рестрикции, чтобы проверить высвобождение вставленного фрагмента ДНК путем рестрикционного пищеварения.

Затем ретрансформируйте плазмиды, показывающие высвобождение вставки после рестрикции пищеварения в штамме делеции ell1, чтобы проверить их способность спасать генотоксический стресс-чувствительный фенотип штамма делеции ell1. ell1-удаленный штамм Schizosaccharomyces pombe показал чувствительность к 4-NQO по сравнению со штаммом дикого типа. Большое количество колоний получается на пластине, лишенной 4-NQO.

Однако на пластине 4-NQO было получено меньше трансформантов, поскольку они действуют как карательные супрессоры чувствительности 4-NQO нулевого мутанта ell1. Из 620 трансформаторов 74 показали рост на 0,4-микромолярной 4-NQO. Было замечено, что только 16 из 74 показали рост в присутствии 0,8-микромолярного 4-NQO.

Деформация делеции ell1 трансформировалась с пустым вектором, и все 16 трансформантов показали рост на пластине, лишенной 4-NQO. Мутант делеции ell1, содержащий только пустой вектор, не показал роста при 0,8-микромоляре 4-NQO, а шесть трансформантов показали рост при 0,8-микромоляре 4-NQO, предполагая, что клоны библиотеки, присутствующие в них, могут подавлять фенотип генотоксического стресса нулевого мутанта ell1. Рестрикционное переваривание плазмиды-супрессора 84 и 104 высвобождало вставку из одного килобаза и 800 пар оснований соответственно.

Повторное введение клонов плазмиды-супрессора в нулевой мутант ell1 привело к подавлению 4-NQO-ассоциированной чувствительности роста. Однако в присутствии MMS плазмиды-супрессоры, содержащие мутант делеции ell1, показали больший рост, чем плазмиды с пустым вектором. Эти генетические скрининги могут очерчивать потенциальные механизмы резистентности и идентифицировать белковые мишени новых антибактериальных, противогрибковых, противопаразитарных или противоопухолевых соединений.

Они также могут выявить механизм действия фармацевтических препаратов.