Одновременная визуализация и обнаружение на основе проточной цитометрии множественных флуоресцентных маркеров старения в терапевтических стареющих раковых клетках, вызванных терапией

Этот метод может быстро генерировать изображения с высоким разрешением, которые позволяют анализировать пространственное распределение и количественную оценку флуоресцентных сигналов в клетках, обеспечивая при этом быстрый анализ нескольких образцов. Клетки измеряются с использованием усовершенствованной системы визуализации потоковой цитометрии, сочетающей скорость, чувствительность и подробные изображения одиночных клеток с пространственной информацией, дающей уникальные данные, которые не могут быть предоставлены оптометрией потоков или микроскопией. Одним из важных советов является предоставление достаточного количества ячеек для установления настроек прибора, и мы подвешиваем ячейки с высокой плотностью для измерений.

Кроме того, сбор данных прост и аналогичен обычной проточной цитометрии. Сначала сгенерируйте клеточные линии DLBCL, как описано в рукописи. Затем добавляют 10 миллимоляров раствора EdU в соотношении один к 1000 в культуру клеток DLBCL и инкубируют пластину в 5%-ном инкубаторе диоксида углерода при 37 градусах Цельсия в течение трех часов после смешивания пластины мягким раскачиванием.

Выньте пластину после инкубации и добавьте 100 растворов миллимолярного хлорохина до конечной концентрации 75 микромоляров. Аккуратно перемешать, покачивая, и инкубировать в течение 30 минут. Затем добавляют 20 растворов миллимоляров C12 FDG до конечной концентрации 20 микромоляров.

После тщательного перемешивания высиживайте пластину в течение одного часа, как было показано ранее. Затем добавьте 100 миллимоляров 2-фенилэтил-бета-d-тиогалактозида в один-50, чтобы остановить окрашивание бета-гала FSA. И аккуратно поверните пластину, чтобы перемешать.

Перенесите клетки в 15-миллилитровые стерильные центрифужные трубки и вращайтесь в 100 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Как только супернатант будет выброшен, промыть клетки четырьмя миллилитрами PBS и центрифугой в 100 раз больше G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем повторно суспендируют клеточные гранулы в 500 микролитрах при 4% растворе для фиксации параформальдегида.

После 10-минутной инкубации при комнатной температуре центрифугируют при 250 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и промыть ячейки четырьмя миллилитрами PBS дважды и центрифугировать в 100 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре. После промывки выбросьте супернатант и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 200 микролитрах буфера пермеабилизации сапонина.

Теперь переложите суспензию в новую 1,5-миллилитровую трубку и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Гранулируйте ячейки в 250 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем повторно приостанавливают клетки в 200 микролитрах раствора первичных антител и инкубируют при четырех градусах Цельсия в течение ночи, в темноте.

Центрифугируйте трубки в 250 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и промойте 100 микролитрами раствора для промывки сапонина. После промывки клеток дважды отбросьте супернатант и повторно приостановите гранулы клеток в 500 микролитрах коктейля обнаружения EdU.

Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте и центрифугировать в 250 раз в G в течение пяти минут при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта и промойте одним миллилитром промывочного раствора сапонина. Повторите промывку два раза, выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулы ячейки в 20-50 микролитрах PBS.

Перед включением прибора опорожните бутылку с отработанной жидкостью и проверьте уровни SpeedBeads, стерилизатора, очистителя, дебублера и достаточного количества жидкостей. После включения прибора и программного обеспечения для обработки изображений нажмите кнопку запуска, чтобы инициализировать флюидику и калибровку системы. Установите увеличение в 40 раз и установите низкую скорость жидкости.

После включения лазеров включите 405-нанометровый лазер для измерения EdU Pacific Blue, 488 нанометров для измерения C12-FDG и 642 нанометра для измерения Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Установите шестой канал для канала рассеяния, первый канал и девятый канал для яркого поля. Затем начните с образца, который, как ожидается, будет иметь самую высокую флуоресценцию, чтобы установить интенсивность лазеров, и осторожно переверните пробу для смешивания.

Открыв крышку трубки, вставьте пробку в док. Нажмите кнопку Загрузить, чтобы начать и открыть точечную диаграмму. Затем выберите область «Функции», подчеркните MO1 и подчеркните соотношение сторон MO1 для осей X и Y соответственно.

Установите задворку выше соотношения сторон 0,5, чтобы исключить дублеты и агрегаты ячеек ниже и с правой стороны и популяцию SpeedBead с левой стороны. Теперь откройте Histogram Plot и выберите корневой средний квадрат корневого градиента объекта маски один и первого канала для оси X. Выберите популяцию синглетов и установите ворота для выбора сфокусированных ячеек.

Откройте график гистограммы и выберите максимальную интенсивность пикселей для второго, седьмого и 11-го каналов оси X. Затем отрегулируйте мощность лазера 488 нанометров, 405 нанометров и 642 нанометров лазеров для второго канала, семи и 11 соответственно, чтобы каждый фторхром имел необработанное максимальное значение пикселя от 100 до 4 000, чтобы избежать перенасыщения. Выберите сфокусированную популяцию для записи и нажмите «Получить», чтобы измерить образцы DLBCL с согласованными настройками.

При замене образцов для измерения нажмите кнопку возврата, чтобы восстановить пробу. Нажмите кнопку Загрузить, чтобы удалить образец. После того, как все образцы будут измерены, выключите яркое поле и рассейте лазер.

Измерьте одноцветные контрольные образцы для создания компенсационной матрицы. Нажмите кнопку Shutdown (Завершение работы), чтобы закрыть систему обработки изображений. Анализируйте данные в программном обеспечении для анализа изображений.

Используйте инструмент Spot Wizard программного обеспечения для анализа изображений для автоматического подсчета и количественной оценки ядерных гамма-фокусов H2AX и изображений живых клеток. Выберите две популяции клеток, одну с высоким и одну с низким количеством пятен, чтобы обучить Spot Wizard для дальнейшего автоматического анализа количества пятен. Метод проточной цитометрии на изображениях одиночных клеток показал увеличение C12-FDG положительного, EdU отрицательного, гамма H2AX положительного, сенексированной популяции и KARPAS422.

Клетки WSU-DLCL2 и OCI-LY1, но не в клетках SU-DHL6. Анализ на основе визуализации показал значительно более высокое количество гамма-фокусов H2AX и KARPAS422, WSU-DLCL2 и OCI-LY1, но не в клетках SU-DHL6. Аналогичные результаты были представлены данными о частоте и количественной оценке.

Добавление сапонина в клеточную суспензию имеет решающее значение, в противном случае антитела не могут достичь внутренних антигенов клетки, а жесткие моющие средства приводят к потере сигнала C12-FTG Визуализационная цитометрия оптимальна для анализа изменений локализации маркеров, таких как транслокация транскрипционного фактора в ядро в ответ на определенные стимулы. Такой анализ также может быть достигнут с помощью нашего протокола. Этот метод позволяет визуализировать несколько флуоресцентных маркеров на одноклеточном уровне, что помогает обнаружить наличие, интенсивность и локализацию отдельных сигналов.