Трехмерное окрашивание цельной почки с помощью CUBIC
18 июля 2022 г.
Настоящий протокол описывает метод очистки тканей и полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание для трехмерной (3D) визуализации почек. Этот метод может предложить макроскопические перспективы в патологии почек, что приводит к новым биологическим открытиям.
Этот протокол позволяет визуализировать трехмерные структуры в полной почке, что может привести к инновационным открытиям в исследованиях почек, обеспечивая макроскопическую перспективу. Окрашивание органов цельным креплением является сложной задачей из-за сложности проникновения антител. Этот протокол продемонстрировал высокое качество, полностью установленное окрашивание почек антителами.
Для начала выполните фиксацию погружения сразу после фиксации перфузии и забора проб почек, погружая почку в 4%-ный параформальдегид при четырех градусах Цельсия в течение 16 часов. Дайте три стирки с использованием PBS в течение двух часов каждая. Выполните процесс обесцвечивания и делипидации, погружая неподвижную почку в семь миллиметров 50% CUBIC-L в 14-миллилитровую трубку с круглым дном, с легким встряхиванием при комнатной температуре.
Через шесть часов погрузить почку в семь миллилитров CUBIC-L в 14-миллиметровую трубку с круглым дном, с легким встряхиванием при 37 градусах Цельсия в течение пяти дней. Обновляйте CUBIC-L каждый день. После завершения обесцвечивания и делипидации используйте дозирующую ложку для обработки образцов и трижды промывайте почки PBS при комнатной температуре в течение двух часов.
Разбавить делипидированную почку в первичных антителах, разведенных в окрашивающем буферном растворе, с легким встряхиванием в шейкере инкубатора при 37 градусах Цельсия в течение семи дней. Затем промывайте почки 0,5% тритоном X-100 в PBS, также известным как PBST, при комнатной температуре в течение одного дня. Для окрашивания вторичных антител обрабатывают почки вторичными антителами в буфере окрашивания, в темноте, с легким встряхиванием при 37 градусах Цельсия в течение семи дней.
Зафиксируйте окрашивание с помощью промывки PBST при комнатной температуре в течение одного дня. После фиксации погружают почку в 1%-формальдегид в ПБ на три часа, и промывают ее ПБС при комнатной температуре в течение шести часов. Выполняют согласование показателя рефракции путем погружения почки в семь миллилитров 50%CUBIC-R+ в 14-миллилитровую трубку круглого дна с встряхиванием на один день, с последующим лечением семью миллилитрами CUBIC-R+ с встряхиванием при комнатной температуре в течение двух дней.
С помощью метода иммунного окрашивания симпатические нервы и артерии во всей почке были визуализированы в 3D-визуализации почек. Более того, аномальные почечные симпатические нервы были визуализированы после ишемии-реперфузионной травмы. Этот протокол также облегчал визуализацию симпатических нервов во всей селезенке.
Процесс количественной оценки данных для трехмерного иммунофлуоресцентного окрашивания показан здесь. Кроме того, собирали протоки, сегмент S1 проксимальных канальцев и клубочки успешно визуализировались в целой почке. Подавленная гломеруломегалия, возникающая в результате введения препарата на ранних стадиях диабетической болезни почек, также визуализировалась в 3D-визуализации.
Этот протокол может маркировать конкретную молекулу во всей почке. Таким образом, исследователи могут проанализировать изменение структуры в сосудистой системе или найти редкие события в тканях почек.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный протокол позволяет визуализировать трехмерные структуры в целой почке, обеспечивая макроскопический обзор, который может привести к инновационным открытиям в исследовании почек. Метод включает осветление тканей и иммунофлуоресцентное окрашивание целого препарата для повышения качества визуализации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Патология
Теоретические основы
- Окрашивание органов целиком затруднено из-за проблем с проникновением антител.
- Высокое качество окрашивания имеет решающее значение для точной 3D-визуализации.
- Данный протокол позволяет решить распространенные проблемы при визуализации почек.
- Макроскопический подход может привести к новым биологическим открытиям.
Цель исследования
- Разработать надежный метод трехмерной визуализации почки.
- Улучшить визуализацию структур почки.
- Способствовать инновационным открытиям в области патологии почек.
Используемые методы
- Иммерсионная фиксация в 4% параформальдегиде при 4°C в течение 16 часов.
- Промывка в PBS трижды по два часа за каждую процедуру.
- Обесцвечивание и удаление липидов с использованием 50% CUBIC-L.
- Осторожное встряхивание при комнатной температуре в процессе удаления липидов.
Основные результаты
- Продемонстрировано высококачественное окрашивание почек целиком.
- Достигнуто улучшенное проникновение антител.
- Обеспечена четкая 3D-визуализация структур почек.
- Реализован макроскопический обзор для лучшего понимания патологии почек.
Выводы
- Данный протокол успешно совершенствует методы визуализации почек.
- Он открывает возможности для новых открытий в исследованиях почек.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для получения более глубоких знаний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Трехмерное окрашивание всей почки с помощью CUBIC позволяет проводить комплексную визуализацию микроструктур почек, преодолевая ограничения традиционной патоморфологии. Эта возможность обеспечивает высокоразрешающее картирование кровеносных сосудов, канальцев, клубочков и симпатических нервов, предоставляя критически важные данные для раннего обнаружения патологий и механистического снижения рисков при исследовании заболеваний почек. Данный метод повышает прогностическую достоверность на ключевых этапах продвижения портфеля доклинических исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать архитектуру почек и клеточные сети с разрешением до одной клетки.
- Способствует снижению биологических рисков путем визуализации структурных изменений после повреждения или вмешательства.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней за счет комплексного картирования симпатических нервов и клубочков.
- Повышает прогностическую достоверность при определении приоритетных мишеней для терапии заболеваний почек.
Скрининг и разработка методов анализа
- Позволяет подготавливать валидированные трехмерные биологические системы для последующей визуализации и количественного анализа.
- Стандартизирует окрашивание органов целиком для получения воспроизводимых количественных результатов в различных исследованиях.
- Обеспечивает возможность масштабируемой визуализации редких событий и структурных изменений в тканях почек.
- Служит основой для надежной оценки влияния соединений на микроанатомию почек.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты 3D-визуализации с биомаркерами, значимыми для заболевания, такими как гломеруломегалия.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации путем визуализации эффектов вмешательства.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе комплексного анализа тканей.
- Обеспечивает прогностическое снижение рисков для программ трансляционных исследований почек.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол 3D-окрашивания всей почки интегрируется в континуум от этапа первичных открытий до доклинических исследований, поддерживая проверку гипотез, валидацию мишеней и согласование трансляционных биомаркеров в исследованиях почек.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем картирования структур почек и ответов на повреждение.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые результаты 3D-визуализации, готовые для анализа, для количественного сравнения экспериментальных условий.
- Аналитика: позволяет измерять и количественно оценивать структурные изменения, обеспечивая надежный статистический анализ.
- Трансляционные исследования: связывает результаты визуализации с моделями заболеваний и ранней идентификацией биомаркеров.
- Повторное корпоративное использование: создает многократно используемую платформу для визуализации органов в целом при исследовании почек и смежных тканей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при валидации почечных мишеней.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, масштабируемые и воспроизводимые рабочие процессы 3D-визуализации.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет обеспечения комплексного анализа тканей.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению программ по лечению заболеваний почек.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области просветления тканей, иммуноокрашивания и анализа 3D-изображений.
- Необходим доступ к современному оборудованию для визуализации и инструментам компьютерного анализа.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Может потребоваться адаптация метода для различных систем органов или панелей антител.
- Проникновение антител и продолжительность окрашивания являются практическими ограничениями при визуализации органов целиком.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
